農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)實現(xiàn)高效DNA定向插入

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授胡宇飛課題組在國家自然科學(xué)重點基金等項目的資助下，在擬南芥中利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)實現(xiàn)轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA）的高效定點插入，并開發(fā)出兩種應(yīng)用。近日，相關(guān)成果發(fā)表于《植物雜志》（Plant Journal）。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的T-DNA定點插入。研究團隊供圖

位點特異性DNA插入（site-specific DNA insertion）是作物育種和基因功能分析的重要工具，可以將功能性元件插入特定基因組位點，并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來的表達差異。在過去幾十年里，許多努力未能實現(xiàn)令人滿意的效率。

傳統(tǒng)的位點特異性DNA插入方法基于同源重組修復(fù)機制，然而，植物細胞中同源重組修復(fù)的低活性使得需要多個世代，篩選大量后代，因而低效。與同源重組修復(fù)介導(dǎo)的插入低效相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合效率高，是植物遺傳工程的主要手段。然而，T-DNA整合依賴非同源末端連接途徑，在植物基因組中的插入位點具有隨機性。

該研究開發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導(dǎo)的擬南芥靶向T-DNA插入的方法。該方法比同源重組修復(fù)介導(dǎo)的方法更快速、高效，并以此開發(fā)了基因激活和雄性生殖細胞特異性基因標(biāo)記兩種應(yīng)用?；蚣せ钔ㄟ^在T-DNA的LB端設(shè)置CaMV35S啟動子，定點插入激活特定的下游基因。利用該技術(shù)實現(xiàn)了FT和MYB26的激活，顯著增加了轉(zhuǎn)錄表達，分別導(dǎo)致早花和花藥內(nèi)壁次生壁增厚模式的改變。

雄性生殖細胞特異性基因標(biāo)記的T-DNA中包含兩個報告基因，即NeoR和MGH3::mCherry，有助于創(chuàng)建定點插入突變體，簡化突變等位基因的遺傳分析，并可對受精過程的生殖細胞進行活體追蹤。該研究成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用于靶向精細胞特異表達，參與精卵識別的基因GEX2。