中國(guó)科大揭示反向剪接調(diào)控的新機(jī)制

10月25日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部單革/王小林團(tuán)隊(duì)在Molecular Cell在線(xiàn)發(fā)表題為“ZC3H14 facilitates backsplicing by binding to exon-intron boundary and 3' UTR”的研究論文，揭示了ZC3H14蛋白結(jié)合成環(huán)序列外顯子-內(nèi)含子邊界和3' UTR促進(jìn)反向剪接的新機(jī)制，并建立了ZC3H14和環(huán)形RNA的生物發(fā)生與雄性生育的緊密聯(lián)系。

該團(tuán)隊(duì)基于無(wú)內(nèi)含子基因來(lái)源的環(huán)形RNA構(gòu)建了circGFP報(bào)告系統(tǒng)，進(jìn)行全基因組CRISPR-Cas9敲除篩選，鑒定出ZC3H14蛋白作為環(huán)形RNA生成的正調(diào)控因子。ZC3H14能夠促進(jìn)約40%環(huán)形RNA的生成，但對(duì)mRNA的表達(dá)與可變剪切沒(méi)有顯著影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析表明，這一調(diào)控機(jī)制在真核生物中是保守的。

通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)ZC3H14蛋白結(jié)合多種剪切體組分。進(jìn)一步的雙分子熒光互補(bǔ)及熒光免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，ZC3H14蛋白可以二聚化甚至寡聚化。ZC3H14 iCLIP-seq分析表明，ZC3H14蛋白結(jié)合成環(huán)外顯子兩側(cè)的外顯子-內(nèi)含子邊界 (Exon-intron boundary, EIB) 及同源基因3' UTR。ZC3H14結(jié)合EIB的突變或3' UTR缺失均導(dǎo)致環(huán)形RNA的表達(dá)降低，ZC3H14與3' UTR的結(jié)合能夠增強(qiáng)ZC3H14與EIB的結(jié)合。單獨(dú)或聯(lián)合利用ZC3H14結(jié)合的EIB或3' UTR作為順式元件，能夠用于環(huán)形RNA表達(dá)載體的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)環(huán)形RNA不同程度的過(guò)表達(dá)。

ZC3H14蛋白在人類(lèi)與小鼠睪丸組織中高度表達(dá)。ZC3H14的敲除導(dǎo)致雄性小鼠后代減少、睪丸減小、精子數(shù)目減少且異常精子比例升高，同時(shí)睪丸組織中環(huán)形RNA的表達(dá)顯著降低。ZC3H14主要表達(dá)在粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期精母細(xì)胞與圓形精細(xì)胞。ZC3H14敲除導(dǎo)致減數(shù)分裂進(jìn)程異常，造成粗線(xiàn)期及雙線(xiàn)期聯(lián)會(huì)復(fù)合物側(cè)軸斷裂，同時(shí)伴隨粗線(xiàn)期精母細(xì)胞環(huán)形RNA表達(dá)水平降低。在小鼠生殖細(xì)胞中，ZC3H14同樣結(jié)合成環(huán)序列兩側(cè)的EIB與3' UTR。此外，通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，作者發(fā)現(xiàn)ZC3H14及環(huán)形RNA與人類(lèi)非梗阻性無(wú)精癥顯著相關(guān)。