【CACA周刊-學科新知】cfDNA在淋巴瘤診斷和預后預測中的價值

前言概述

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學科新知聚焦業(yè)內(nèi)權(quán)威專家，從學科發(fā)展的高度全面梳理、深入解讀腫瘤醫(yī)學各領(lǐng)域的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與進展，為醫(yī)護以及科研人員立體勾勒惡性腫瘤領(lǐng)域的最新研究進展，賦能臨床科研和學術(shù)推廣，為醫(yī)學研究者搭建一個共享知識、交流經(jīng)驗的平臺，推動腫瘤醫(yī)學領(lǐng)域的國際化合作與發(fā)展。

本期學科新知分享的是蘇州大學附屬第二醫(yī)院李炳宗教授對淋巴瘤cfDNA診斷和預后預測進展的精彩解讀。

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cfDNA的臨床應用現(xiàn)狀

活檢，是“活體組織檢查”簡稱，亦稱外科病理學檢查，是指應診斷、治療的需要，從患者體內(nèi)切取、鉗取或穿刺等取出病變組織，進行病理學檢查的技術(shù)?；顧z是診斷病理學中最重要的部分，對絕大多數(shù)送檢病例都能做出明確的組織病理學診斷，被作為臨床的最后診斷。在惡性腫瘤的診療中，影像學檢查，如CT掃描或MRI，有助于檢測腫塊或不規(guī)則組織，但僅憑這些檢查無法區(qū)分癌性細胞和非癌性細胞。病理診斷則被公認為惡性腫瘤診斷的“金標準”，在此過程中，活檢是必不可少的步驟。

液體活檢，也稱為液態(tài)活檢或液相活檢，指以體液為檢材獲得腫瘤生物信息的體外診斷技術(shù)?？捎糜谝后w活檢的體液包括血液、尿液、糞便、腦脊液、唾液、胸腔或腹盆腔積液等，檢測對象主要有游離核酸、腫瘤細胞、細胞外囊泡、血小板等。

人體細胞凋亡和壞死后會釋放片段化DNA到體液中，稱為游離DNA（cfDNA）。cfDNA長度主要分布在一個核小體的范圍內(nèi)，長度約為166 bp，其次分布于300 bp（雙核小體）和500 bp（三核小體）范圍。cfDNA的半衰期很短，約為30 min~2 h，其含量的變化可以更實時地反映腫瘤負荷[1]。在健康人群正常器官組織來源的cfDNA中，淋巴樣細胞和髓樣細胞的脫落DNA所占比例最大。在cfDNA中，部分來自腫瘤細胞的DNA則被稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。ctDNA會攜帶來源于腫瘤細胞相關(guān)的遺傳學特征，如基因突變、甲基化、擴增或重排等，可作為腫瘤篩查、伴隨診斷、治療療效評估及預后風險分層的重要指標。

在健康人血清中，cfDNA的含量為0~100 ng/ml，平均約為30 ng/ml，而腫瘤患者血清中的含量差異較大，在0~1000 ng/ml，平均約為180 ng/ml?；诖耍篶fDNA含量的檢測對于腫瘤早期診斷和治療后監(jiān)測具有顯著價值。國內(nèi)首個前瞻性、盲法、獨立驗證研究（THUNDER）發(fā)現(xiàn)在肺癌、腸癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌和食管癌6大癌種中基于cfDNA的液體活檢在癌癥早篩的獨立驗證中可達到98.9%的特異性、69.1%的敏感性以及83.2%的組織溯源準確性。在真實世界模擬中實現(xiàn)了70.6%的靈敏度，可將晚期發(fā)病率降低38.7%-46.4%，五年生存率提高33.1%-40.4%[2]。

淋巴瘤是一類起源于淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。目前診斷淋巴瘤和評估腫瘤生物學特征仍然主要依賴于病變組織的組織病理活檢。然而組織病理活檢有些情況下面臨著取材困難的問題，而影像學評估始終面臨敏感性不足和對腫瘤負荷精確定量困難的難題。此外，基于PHOENIX和RUBUST研究的失敗結(jié)果，也表明基于細胞起源的病理分型無法準確指導靶向藥物的治療，而根據(jù)基因分型及相關(guān)的信號通路異常來指導各種分子靶向藥物在淋巴瘤治療中的應用是有臨床價值的[3，4]。

國外的一項使用cfDNA甲基化特征在多癌種的檢測與定位的研究開發(fā)了用于癌癥檢測和組織起源定位的分類器，發(fā)現(xiàn)其在驗證集中特異性可達99.3%，假陽性率為0.7%。檢測率隨著分期的增加而增加：在預先指定的癌癥類型中，Ⅰ期敏感性為39%，Ⅱ期敏感性為69%，Ⅲ期為83%，Ⅳ期為92%。在所有癌癥類型中，Ⅰ期敏感性為18%，Ⅱ期敏感性為43%，Ⅲ期敏感性為81%，Ⅳ期為93%。在淋巴瘤中，訓練集的敏感性在Ⅰ期（n=15）約為23%，Ⅱ期（n=28）約為75%，Ⅲ期（n=27）約為78%，Ⅳ期（n=39）約為80%；驗證集的敏感性在Ⅰ期（n=7）約為60%，Ⅱ期（n=12）約為100%，Ⅲ期（n=12）約為85%，Ⅳ期（n=39）約為100%。此外，通過混淆矩陣表示訓練集和驗證集中組織溯源的準確性，發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤中，訓練集具有高達92%的準確率，同時，驗證集中的準確性也可達85%。因此，基于cfDNA信息甲基化模式的測序在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性階段檢測中的特異性及敏感性可接近人群水平篩查的目標[5]。

綜合上述研究結(jié)果，基于cfDNA的檢測方法具有特異性高、敏感性高等特性。非侵入性的檢測方式也為患者提供諸多便利。

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cfDNA在常見淋巴瘤診斷和預后預測中的價值

淋巴瘤在原發(fā)腫瘤內(nèi)和跨疾病部位都表現(xiàn)出空間異質(zhì)性。隨著時間的推移和治療壓力的影響，克隆選擇和進化可導致額外的臨床相關(guān)異質(zhì)性。因此，單次活檢可能無法反映疾病生物學的全部。由于cfDNA包含從所有疾病部位脫落的分子，因此該檢測可以更準確地描述相關(guān)突變。此外，在解剖學困難的部位，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）淋巴瘤或放射學上隱匿性疾病中可能無法進行活檢。雖然切除活檢仍然是“金標準”，但液體活檢方法可能在診斷和復發(fā)的基因分型中發(fā)揮越來越重要的作用。

在彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中，一項從游離DNA片段譜推斷基因表達的研究當中，通過基于cfDNA片段特征開發(fā)了表觀遺傳表達推斷（EPIC-seq）分析方法。通過EPIC-seq技術(shù)對DLBCL患者的預處理血液樣本進行分析檢測cfDNA中的表觀遺傳信號，從而非侵入性地識別DLBCL病例，并區(qū)分癌癥患者與健康對照者。在訓練集中，此技術(shù)在區(qū)分DLBCL患者（n=91）和非癌癥對照者（n=71）時表現(xiàn)出強大的性能（AUC=0.92）。在應用于DLBCL患者（n=23）和非癌癥對照參與者（n=23）的驗證隊列時，觀察到在區(qū)分癌癥和非癌癥方面有相似的表現(xiàn)（AUC=0.96）。在治療期間，患者的EPIC-seq評分顯示出與ctDNA濃度隨時間變化的強烈且顯著的相關(guān)性，表明依據(jù)cfDNA可以無創(chuàng)地檢測組織來源的DLBCL信號，并真實反映DLBCL治療前后的疾病負擔。在DLBCL的亞型分類中，基于EPIC-seq分析的結(jié)果可明顯區(qū)分GCB亞型與ABC亞型，相比于Hans算法，此類無創(chuàng)分類方法可更好地對患者進行分型[6]。

此外，國外學者也通過定向變異（PVs）富集和檢測測序（PhasED-seq）的方法，通過測定單個DNA片段中的多個體細胞突變來提高ctDNA檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)其在治療期間和復發(fā)之前都能有效提高臨床樣本的ctDNA陽性檢測率，且能應用于實體瘤患者。從三個獨立的DLBCL患者的全基因組測序（WGS）中識別可能存在的PVs并追蹤殘留病灶，結(jié)果表明，PhasED-seq檢測出的單核苷酸變異（SNV）和PVs的數(shù)量有顯著提高。在比較PhasED-seq與其他ctDNA檢測方法（CAPP-seq或雙鏈測序）中，研究團隊將三名淋巴瘤患者中提取出ctDNA并將其稀釋到健康對照cfDNA中，結(jié)果表明PhasED-seq的測序錯誤率更低且對ctDNA的檢測率顯著提高。通過對一名接受治療的DLBCL患者的cfDNA測序進行檢測實用性應用，發(fā)現(xiàn)CAPP-seq僅在患者經(jīng)過一個周期的治療后就無法檢測到ctDNA，經(jīng)250天后可檢測出，五個月后患者便出現(xiàn)了臨床疾病進展。與此相反的是通過CAPP-seq檢測不到的ctDNA可由PhasED-seq檢出，大大提前了ctDNA的檢測時間。隨后，研究團隊進一步評估了phasED-seq在107名接受標準免疫化療的B細胞淋巴瘤患者中的表現(xiàn)，結(jié)果也都表明PhasED-seq檢測ctDNA的優(yōu)越性[7]。

在經(jīng)CAR-T治療后失敗的大B細胞淋巴瘤患者中，通過cfDNA的低通全基因組測序（lpWGS）以確定DNA拷貝數(shù)改變（CNA）。表示基因組不穩(wěn)定性的高局灶性CNA評分（FCS）在多變量選擇中，是與較差的3個月完全緩解率、無進展生存期和總生存期相關(guān)的最重要的預處理變量。研究共在89%（108/122）患者中發(fā)現(xiàn)34個獨特的局灶性CAN。其中，導致FAS死亡受體喪失的10q23.3缺失與不良結(jié)局的相關(guān)性最高，導致PFS和OS較差。研究還發(fā)現(xiàn)高FCS與超過1個淋巴結(jié)外病變部位相關(guān)，但與反映腫瘤體積增加的疾病特征，例如乳酸脫氫酶（LDH）升高不存在關(guān)聯(lián)?；诖税l(fā)現(xiàn)，團隊構(gòu)建了包含高FCS、升高的LDH和>1淋巴結(jié)外位點的風險分層模型，發(fā)現(xiàn)此模型可以識別出CRA-T治療后12個月時PFS僅為4%的高風險患者組[8]。

在套細胞淋巴瘤（MCL）中，對于37名復發(fā)/難治性B細胞淋巴瘤患者（18名MCL患者）聯(lián)合使用BTK抑制劑（ibrutinib）和泛PI3K抑制劑（buparlisib）治療進行了一項單中心Ⅰ/Ⅰb期試驗，并在之后進行cfDNA樣本的連續(xù)監(jiān)測。研究發(fā)現(xiàn)，血漿ctDNA突變與腫瘤突變高具有度一致性。在MCL患者樣本中，在基線血漿樣本中檢測到患者攜帶MSI1 N247S和TET2 H877L突變，而在該患者的腫瘤樣本中未發(fā)現(xiàn)這些突變。此外，在可檢測到ctDNA的MCL患者中，ctDNA的變化與患者的治療響應和疾病進展緊密相關(guān)，并且在部分復發(fā)患者中，ctDNA的增加先于影像學上的復發(fā)跡象。ctDNA的動態(tài)變化能夠反映腫瘤負荷和預測復發(fā)，揭示疾病進展的早期信號，在監(jiān)測治療效果和疾病演變方面具有敏感性。耐藥性檢測方面，血漿ctDNA測序揭示了治療過程中可能出現(xiàn)的耐藥性突變，早于影像學進展[9]。

T細胞淋巴瘤是一種高度侵襲性的腫瘤，具有顯著的異質(zhì)性。在血管免疫母細胞亞型中，ctDNA中的G17V RHOA突變被證明在預測腫瘤DNA突變狀態(tài)方面具有100%的敏感性和特異性[10]。在結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤亞型中，配對基線腫瘤組織和cfDNA的基因分型結(jié)果之間具有一致性，cfDNA濃度較低時患者具有更好的生存結(jié)果[11]。另一項研究也顯示治療后未檢測到ctDNA的患者的完全緩解率高于治療后持續(xù)檢測到ctDNA的患者[12]。cfDNA/ctDNA在淋巴瘤治療后微小殘留病灶（MRD）評估中也具有極大的潛力。在檢測同種異體造血干細胞移植的淋巴瘤患者中MRD的存在與復發(fā)/進展之間的關(guān)聯(lián)的研究中，84%（16/19）患者在復發(fā)/進展前3.7個月內(nèi)檢測到了ctDNA。同ctDNA陰性患者相比，同種異體造血干細胞移植后三個月可檢測到ctDNA的患者的無進展生存率較低。因此基于ctDNA的檢測在T細胞淋巴瘤的診斷、預后、治療反應評估和MRD評估中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。

大多數(shù)經(jīng)典霍奇金淋巴瘤患者要么治療過于集中而遭受不必要的副作用，要么治療不夠集中而出現(xiàn)復發(fā)，因而個體化治療在改善治療結(jié)果及減少副作用方面十分必要。在個體化治理策略中可通過準確的風險評估進行預先治療，或準確評估治療反應以在治愈后立即停止治療。國外學者團隊基于此設計一個有針對性的ctDNA測序和生物信息學平臺，以期在隨訪期間進行準確的基線基因分型和MRD檢測。團隊發(fā)現(xiàn)cfDNA的檢測可在0.5%的突變等位基因頻率（mAF）下實現(xiàn)高度敏感和特異的突變檢測。該技術(shù)能可靠地區(qū)分出低至0.025% mAF的MRD。臨床驗證階段，通過比對cfDNA樣本中的檢測到的變異與活檢樣本相比，可確認所有mAF大于4%的突變（26/26）和91.3%的所有突變（63/69）。對于拷貝數(shù)評估，研究將cfDNA中9p24.1區(qū)域（PD-L1基因所在位置）的增益與熒光原位雜交（FISH）這一金標準進行了對比，二者之間存在強相關(guān)性，顯示出cfDNA在檢測診斷中的巨大潛力[14]。

cfDNA在淋巴瘤中的應用不僅增強了疾病的分子層面理解，也為患者提供了更加精準的治療監(jiān)測和管理手段，是推動淋巴瘤個體化醫(yī)療向前發(fā)展的重要工具。

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中國智慧助力cfDNA光明未來

在2023年第65屆美國血液學會（ASH）年會中，一項“腦脊液和血漿循環(huán)游離DNA在新診斷彌漫性大B細胞淋巴瘤中的診斷和預后價值”成功入選口頭報告環(huán)節(jié)，展示了中國學者在此領(lǐng)域的探索與創(chuàng)新[15]。

研究入組了43例DLBCL患者（更大樣本的檢測和驗證還在進行中），32例患者血漿cfDNA檢測出基因突變，陽性率達到74%（32/43），遠高于外周血基因組DNA檢測出的陽性率（16%）。其中，28/39（72%）例患者腫瘤組織和血漿cfDNA結(jié)果一致，均為陽性。較高的一致性有助于精確診斷和MRD監(jiān)測。此外，4例患者無法獲取腫瘤組織，但cfDNA檢測為陽性。這也體現(xiàn)出cfDNA輔助診斷對于血管內(nèi)大B細胞淋巴瘤或者其他采樣困難患者的重要性。

相較于骨髓或原發(fā)病灶組織，14/28（50%）例患者血漿cfDNA中檢測出更多突變，更好地反映了腫瘤的異質(zhì)性。7/30例患者腦脊液cfDNA檢測出陽性，其中，3例患者有明確中樞侵犯證據(jù)，4例患者腦脊液暫時無細胞學、流式或影像學異常證據(jù)。可以看出，cfDNA陽性結(jié)果可能作為一種預測早期中樞復發(fā)的生物標志物。目前，我們也在密切觀察這些患者的臨床狀態(tài)。

此外，利用多功能檢測套組同時檢測出點突變（SNV/Indel）、基因拷貝數(shù)變異（CNV）、Ig相關(guān)融合及克隆性免疫球蛋白基因重排，對于提高cfDNA陽性檢出率，進一步探討DLBCL分子機制以及協(xié)助臨床診斷、治療和預后評估都具有非常重要的意義。

淋巴血液病理專業(yè)診斷醫(yī)技人員短缺，實驗室建設、質(zhì)量控制和專業(yè)人員培訓水平參差不齊，一定程度上影響了我國淋巴瘤精準診治前進的步伐。為實現(xiàn)“千變?nèi)f化”的淋巴瘤診療工作規(guī)范化和同質(zhì)化，蘇州大學附屬第二醫(yī)院血液科依據(jù)CACA指南進行了試點和改革。作為江蘇省臨床重點專科和蘇州大學附屬第二醫(yī)院淋巴瘤中心依托單位，該科室依據(jù)“MDT to HIM”理念，聯(lián)合病理科、影像科、核醫(yī)學科和放療科等多個學科組建淋巴瘤MDT團隊和CAR-T細胞MDT團隊，致力于淋巴瘤的規(guī)范化和精準化整合診治。相關(guān)建設成果于2023年8月獲批全國第一批國家淋巴瘤規(guī)范診療質(zhì)量控制試點單位。未來，地方性淋巴瘤診療機構(gòu)將主要依托國家級淋巴瘤病理中心基地開展繼續(xù)教育與專業(yè)人才培訓工作，致力于將淋巴瘤診療規(guī)范化、同質(zhì)化。國家級淋巴瘤病理中心和國家級淋巴瘤臨床診療中心直接對接，建立完整的技術(shù)平臺和相對充分的醫(yī)療、師資人力資源和教學、科研條件十分重要。近年來多組學研究為淋巴瘤的診療提供了諸多新思路，通過研究DNA、RNA、蛋白質(zhì)、表觀遺傳和代謝產(chǎn)物等的構(gòu)成以及在特定條件下這些組分間的相互作用和關(guān)系，融合分析尋找精準的診療靶點，結(jié)合預測模型篩選高?；颊?，最終實現(xiàn)精準分層的個體化治療模式使患者獲益。而這些先進技術(shù)的開展與落地臨床是未來5年發(fā)展的重中之重。

中國抗癌協(xié)會組織權(quán)威專家編寫完成并發(fā)表的《CACA指南-淋巴瘤》反映了我國淋巴瘤治療領(lǐng)域的最新進展，整合了國內(nèi)外淋巴瘤診療領(lǐng)域最好的循證醫(yī)學證據(jù)和臨床經(jīng)驗，將深入指導中國淋巴瘤規(guī)范化、正規(guī)化診斷，促進治療水平的提升。

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