ada

簡(jiǎn)介

腺苷脫氨酶（也稱為腺苷氨基水解酶，或ADA）是參與嘌呤代謝的酶（EC3.5.4.4）。它需要從食物中分解腺苷和組織中核酸的轉(zhuǎn)換。它在人體中的主要功能是免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持。然而，ADA的完整生理作用尚未完全了解。

結(jié)構(gòu)

ADA以小形式（作為單體）和大形式（作為二聚體 - 復(fù)合物）存在。在單體形式中，酶是多肽鏈，折疊成8股平行的α/β桶，其圍繞作為活性位點(diǎn)的中央深口袋。除8個(gè)中心β-桶和8個(gè)外周α-螺旋外，ADA還含有5個(gè)額外的螺旋：殘基19-76倍折成三個(gè)螺旋，位于β1和α1折疊之間;兩個(gè)反平行的羧基末端螺旋位于β-桶的氨基末端。

ADA活性位點(diǎn)含有鋅離子，鋅離子位于活性位點(diǎn)的最深凹陷處，由來(lái)自His15，His17，His214，Asp295和底物的五個(gè)原子配位。鋅是活動(dòng)所必需的唯 一輔助因子。

底物腺苷被穩(wěn)定并通過(guò)9個(gè)氫鍵與活性位點(diǎn)結(jié)合。與基質(zhì)嘌呤環(huán)大致共面的Glu217的羧基在適當(dāng)位置與基質(zhì)的N1形成氫鍵。Asp296的羧基也與底物嘌呤環(huán)共面，與底物的N7形成氫鍵。Gly184的NH基團(tuán)處于與底物的N3形成氫鍵的位置。Asp296與Zn形成鍵離子以及底物的6-OH。His238也與底物6-OH形成氫鍵。底物核糖的3'-OH與Asp19形成氫鍵，而5'-OH與His17形成氫鍵。在活性位點(diǎn)的開(kāi)口處，通過(guò)基質(zhì)的2'-OH和3'-OH，在水分子上形成另外兩個(gè)氫鍵。

由于酶內(nèi)活性位點(diǎn)的凹陷，基質(zhì)一旦結(jié)合，幾乎完全與溶劑隔離。當(dāng)結(jié)合時(shí)，基材對(duì)溶劑的表面暴露是自由狀態(tài)下基材的表面暴露的0.5%。1

反應(yīng)

ADA不可逆地使腺苷脫氨基，通過(guò)用氨基取代酮基將其轉(zhuǎn)化為相關(guān)的核苷肌苷。

然后肌苷可被另一種稱為嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的酶衍生化（從核糖中除去），將其轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤。

催化機(jī)理

所提出的ADA催化脫氨作用機(jī)理是通過(guò)四面體中間體進(jìn)行立體特異性加成 - 消除。通過(guò)任何一種機(jī)制，作為強(qiáng)親電試劑的Zn激活水分子，水分子被堿性Asp295去質(zhì)子化以形成攻擊性氫氧化物。His238定向水分子并穩(wěn)定攻擊氫氧化物的電荷。將Glu217質(zhì)子化以將質(zhì)子提供給底物的N1。

由于鋅，Asp295和His238殘基的位置，反應(yīng)是立體特異性的，其全部面向底物的嘌呤環(huán)的B側(cè)。

已經(jīng)觀察到對(duì)ADA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，其中產(chǎn)物肌苷作用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)酶活性起作用。1

功能

ADA被認(rèn)為是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶之一。該酶已在細(xì)菌，植物，無(wú)脊椎動(dòng)物，脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，具有高度的氨基酸序列保守性。高度的氨基酸序列保守性表明ADA在嘌呤補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵性質(zhì)。

首先，人類的ADA參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持。然而，還觀察到ADA關(guān)聯(lián)與上皮細(xì)胞分化，神經(jīng)傳遞和妊娠維持有關(guān)。還提出，除腺苷分解外，ADA還刺激興奮性氨基酸的釋放，并且是A1腺苷受體和異源三聚體G蛋白偶聯(lián)所必需的。腺苷脫氨酶缺乏會(huì)導(dǎo)致肺纖維化，表明長(zhǎng)期暴露于高水平的腺苷可以加劇炎癥反應(yīng)而不是抑制它們。還已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腺苷脫氨酶蛋白和活性在過(guò)表達(dá)HIF-1α的小鼠心臟中上調(diào)，這部分地解釋了在缺血應(yīng)激期間表達(dá)HIF-1α的心臟中腺苷的減弱水平。

病理學(xué)

腺苷脫氨酶基因中的一些突變導(dǎo)致它不被表達(dá)。由此產(chǎn)生的缺陷是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的一個(gè)原因，特別是常染色體隱性遺傳。ADA水平不足也與肺部炎癥，胸腺細(xì)胞死亡和T細(xì)胞受體信號(hào)缺陷有關(guān)。

相反，導(dǎo)致該酶過(guò)度表達(dá)的突變是溶血性貧血的一個(gè)原因。

有證據(jù)表明不同的等位基因（ADA2）可能導(dǎo)致自閉癥。

ADA水平升高也與艾滋病有關(guān)。

異構(gòu)體

有兩種ADA同種型：ADA1和ADA2。

ADA1存在于大多數(shù)體細(xì)胞中，特別是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，它不僅存在于胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞核中，而且還存在于與二肽基肽酶-4（aka，CD26）連接的細(xì)胞膜上的外胚層中。ADA1主要參與細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，并且以小形式（單體）和大形式（二聚體）存在。小型到大型的相互轉(zhuǎn)換受肺中“轉(zhuǎn)換因子”的調(diào)節(jié)。

ADA2首次在人類脾臟中發(fā)現(xiàn)。隨后在包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的其他組織中發(fā)現(xiàn)它與ADA1共存。這兩種同種型調(diào)節(jié)腺苷與脫氧腺苷的比例，增強(qiáng)了寄生蟲(chóng)的殺滅。ADA2主要存在于人血漿和血清中，并且僅作為同型二聚體存在。

臨床意義

ADA2是人血漿中存在的主要形式，并且在許多疾病中增加，特別是與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾?。豪珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬和結(jié)節(jié)病。在大多數(shù)癌癥中血漿ADA2同種型也增加。ADA2不是普遍存在，而是僅在單核細(xì)胞 - 巨噬細(xì)胞中與ADA1共存。

可以使用高效液相色譜法或酶法或比色法測(cè)量總血漿ADA。也許最簡(jiǎn)單的系統(tǒng)是測(cè)量腺苷在分解為肌苷時(shí)釋放的氨。在用腺苷的緩沖溶液溫育血漿后，氨與Berthelot試劑反應(yīng)形成藍(lán)色，其與酶活性的量成比例。為了測(cè)量ADA2，在孵育之前加入赤 - 9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤（EHNA）以抑制ADA1的酶活性。缺乏ADA1引起SCID。

ADA也可用于淋巴細(xì)胞性胸腔積液或腹膜腹水的檢查，因?yàn)檫@種低ADA水平的樣本基本上不考慮結(jié)核病。

結(jié)核性胸腔積液現(xiàn)在可以通過(guò)增加胸膜液腺苷脫氨酶水平，每升40 U以上來(lái)準(zhǔn)確診斷。

克拉屈濱和Pentostatin是用于治療毛細(xì)胞白血病的抗腫瘤劑;它們的作用機(jī)制是抑制腺苷脫氨酶。

1.肝臟疾病

ADA活性是反映肝損傷的敏感指標(biāo)，可作為肝功能常規(guī)檢查項(xiàng)目之一，與ALT或GGT等組成肝酶譜能較全面地反映肝臟病的酶學(xué)改變。血清中的ADA活性測(cè)定可用于：①判斷急性肝損傷及殘留病變，急性肝炎時(shí)，ADA輕、中度升高，但重癥肝炎發(fā)生酶膽分離時(shí)，ADA明顯升高。急性肝炎后期，ADA增高率高于ALT，其恢復(fù)正常時(shí)間也較后者為遲， ALT恢復(fù)正常而ADA持續(xù)升高者，常易復(fù)發(fā)或易遷延為慢性肝炎。②協(xié)助診斷慢性肝病，可作為慢性肝病的篩選指標(biāo)。慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌患者血清ADA活性顯著升高。其陽(yáng)性率達(dá)85%～90%，慢性活動(dòng)性肝炎ADA活性明顯高于慢性遷延性肝炎，可用于二者的鑒別診斷。③有助于肝纖維的診斷④有助于黃疸的鑒別，阻塞性黃疸血清ADA活性及陽(yáng)性率均明顯低于肝細(xì)胞性黃疸及肝硬化伴黃疸者。

2.結(jié)核的診斷和鑒別診斷

鑒別結(jié)核性和非結(jié)核性胸、腹水及腦脊液是臨床病因?qū)W診斷的一個(gè)常見(jiàn)難題。雖然近年來(lái)有結(jié)核抗體、PCR測(cè)定等新技術(shù)，但由于假陽(yáng)性及價(jià)格等因素，普及應(yīng)用仍受限制。據(jù)報(bào)道，即使多方檢測(cè)，仍有20％左右的積液不能明確病因。因此應(yīng)用ADA檢測(cè)，對(duì)不明原因積液診斷又增添了一項(xiàng)診斷指標(biāo)。結(jié)核菌感染人體雖然能產(chǎn)生抗體，但無(wú)保護(hù)作用，其抗感染免疫主要靠細(xì)胞免疫。細(xì)胞免疫作用是結(jié)核菌激活T淋巴細(xì)胞使其產(chǎn)生增殖，隨之引起巨噬細(xì)胞的活化，活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶大量增多，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的殺傷作用。早在1978年P(guān)iras報(bào)道ADA在結(jié)核性胸水時(shí)P/S>I.0，癌性胸水<1.0(P/S表示液/血比值)，其機(jī)理為：由于各種物質(zhì)的生成、存儲(chǔ)、代謝以及化學(xué)特性、生物學(xué)活性、相對(duì)分子質(zhì)量等各不相同，加之細(xì)胞血管、漿膜的屏障作用在各種因素下的通透性改變，造成了檢測(cè)物質(zhì)在胸水中與血清中濃度上的差異與規(guī)律性比例，為診斷提供有價(jià)值依據(jù)。在胸腹水檢測(cè)中，結(jié)核性胸腹水ADA活性顯著增高，癌性胸腹水不增高，而血清ADA活性無(wú)顯著差異。

3.糖尿病的鑒別診斷

據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，2型糖尿病患者血清ADA 明顯升高，且與HbA1c 有明顯正相關(guān)關(guān)系，1型糖尿病患者的ADA 與H bA1c無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。因此，測(cè)定血清ADA對(duì)于鑒別診斷1型與2型糖尿病、衡量2型糖尿病患者血糖控制好壞有一定的意義。

4.血液病的診斷

血清ADA活性檢測(cè)有助于白血病的臨床分期和分型判斷，白血病的鑒別診斷和慢?；蚵芗弊兊脑缙谠\斷，并可作為判斷患者體內(nèi)白血病細(xì)胞負(fù)荷情況的一項(xiàng)生化指標(biāo)。另外，惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、惡性組織細(xì)胞病和骨髓增生異常綜合征等惡性血液病患者血清中的ADA活性也均升高。

5.系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的病情評(píng)價(jià)

SLE患者血清ADA 活性明顯增高, 且其增高程度與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，監(jiān)測(cè)SLE 患者血清ADA 活性對(duì)評(píng)價(jià)病情及治療效果有重要的臨床意義。

6.其他疾病的輔助診斷 ADA還可用于缺鐵性貧血，腎綜合征出血熱，鼻息肉等疾病的病情觀察及療效評(píng)價(jià)。 總之，ADA活性檢測(cè)已成為多種疾病的輔助診斷指標(biāo)之一，為許多疾病的早期診斷、鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)及治療效果評(píng)價(jià)提供重要的參考價(jià)值。這也是我們檢驗(yàn)科開(kāi)展此項(xiàng)目的目的所在。

檢測(cè)方法演變

近十幾年來(lái)，隨著對(duì)ADA的深入研究，檢測(cè)方法也不斷發(fā)展。目 前已發(fā)展了四代。

第一代ADA測(cè)試

ADA將腺苷 （Adenosine） 脫氨產(chǎn)生次黃苷（Inosine） 和氨 （NH3）。一個(gè)ADA活性單位在測(cè)試特定條件下每分鐘脫氨1μmole腺苷成為次黃苷。通過(guò)動(dòng)態(tài)測(cè)量腺苷265nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算ADA的活性大小。Kaplan法 （1955） 由此建立。由于高底物濃度造成吸光度過(guò)高，該法僅適用于腺苷濃度低于40μM。如此低的底物濃度達(dá)不到底物飽和要求，造成ADA活性檢測(cè)失真。因此，該法不適用于臨床應(yīng)用。

第二代ADA測(cè)試

原理為腺苷脫氨酶催化腺嘌呤核苷水解，產(chǎn)生次黃嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot顯色反應(yīng)（1859）測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生氨的量，從而計(jì)算血清ADA活性單位。所需試劑易配制，儀器簡(jiǎn)單，但靈敏度低，易受外源性NH3影響，空白過(guò)高，不能直接測(cè)定紅細(xì)胞ADA活性。

同樣原因，ADA偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶（Glutamate Dehydrogenase， GLDH）反應(yīng)：

通過(guò)測(cè)量340nm處NADPH吸光度下降的速度來(lái)測(cè)算ADA活性。該法也因血清含氨干擾，以及測(cè)試系統(tǒng)中過(guò)高NADPH造成非特異性氧化而無(wú)成算。

第三代ADA測(cè)試

Kalckar氏應(yīng)用ADA偶聯(lián)嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase，PNP） 和黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase， XOD） 反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。通過(guò)測(cè)量293nm處尿酸鹽吸光度上升的速度來(lái)測(cè)算ADA活性。

但是，293nm時(shí)血清吸光度太高，造成臨床應(yīng)用不便。

第四代ADA測(cè)試

通過(guò)ADA偶聯(lián)PNP，XOD，過(guò)氧化氫酶（Catalase）和醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase），借助過(guò)氧化氫（H2O2）反應(yīng)測(cè)量334nm處NADPH吸光度上升的速率來(lái)測(cè)算ADA活性。該法克服了以往ADA測(cè)試的困難，然而，鑒于試劑成本高，阻礙實(shí)際臨床使用。

最新對(duì)第四代測(cè)試方法的改進(jìn)為偶聯(lián)PNP，XOD和過(guò)氧化物酶（Peroxidase， POD）反應(yīng)。ADA酶解腺苷（Adenosine）脫氨產(chǎn)生次黃苷（Inosine）；再通過(guò)PNP的作用，生成次黃嘌呤（Hypoxanthine）；后者在XOD氧化下生成尿酸（Uric Acid）和過(guò)氧化氫（H2O2）；最后在POD的作用下H2O2再與N-Ethyl-N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-3-methylaniline （EHSPT）、4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine， 4-AA）反應(yīng)（Trinder氏反應(yīng)），生成紫紅色的有色醌（Quinone dye）。通過(guò)動(dòng)態(tài)測(cè)量有色醌550nm處吸光度上升的速度來(lái)測(cè)算ADA的活性。從反應(yīng)原理可知NH4+對(duì)該法無(wú)影響。其原理反應(yīng)方程式如下：

反應(yīng)具有測(cè)定精密度高，抗干擾能力強(qiáng)，適合自動(dòng)化快速測(cè)定的特點(diǎn)，為臨床常規(guī)開(kāi)展ADA檢測(cè)應(yīng)用創(chuàng)造了有利條件。

邁克腺苷脫氨酶（ADA）檢測(cè)試劑盒性能指標(biāo)

檢測(cè)方法：XOD-PAP法（第四代改良法），不與其它核苷反應(yīng)，無(wú)NH4+影響，靈敏度高。

劑 型：液體雙試劑，直接使用，避免復(fù)溶引起瓶間差。

線性范圍：0～200U/L，γ2≥0.99

準(zhǔn) 確 度：不準(zhǔn)確度正常水平≤15%，異常水平≤10%。

穩(wěn) 定 性：密閉避光貯存2～8℃可穩(wěn)定12個(gè)月，開(kāi)瓶上機(jī)2～8℃避光穩(wěn)定30天。

抗干擾能力：標(biāo)本中膽紅素≤342umol/L，血紅蛋白≤200mg/dl，甘油三酯≤8.47mmol/L，抗壞血酸≤4mg/dl 及NH4+對(duì)本試劑測(cè)定無(wú)影響。

適 用 性：適用于各種半/全自動(dòng)生化分析儀。

參考范圍：4～22U/L（37℃），建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的參考值范圍。