中國(guó)科大揭示CRL2 APPBP2 E3泛素連接酶調(diào)控蛋白質(zhì)降解的分子機(jī)制

我校生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部許超教授、張凱銘教授與以色列巴伊蘭大學(xué)Itay Koren教授合作，揭示了CRL2APPBP2E3泛素連接酶識(shí)別底物羧基端降解信號(hào)（C-degron）的分子機(jī)制，相關(guān)成果以“Molecular basis for C-degron recognition by CRL2APPBP2ubiquitin ligase”為題于10月16日在線發(fā)表在《PNAS》雜志上。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是真核細(xì)胞中的主要蛋白質(zhì)降解通路，介導(dǎo)泛素化依賴的蛋白質(zhì)降解，通過(guò)消除不需要或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在典型的E1-E2-E3泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路中，泛素連接酶E3通過(guò)結(jié)合E2~泛素（E2~Ub）和底物，催化泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物特定的賴氨酸上。因此，E3決定了UPS的特異性。在大多數(shù)情況下，它可以直接識(shí)別底物蛋白質(zhì)中的特定基序，這種基序被稱為降解子（degron）。蛋白質(zhì)暴露的羧基末端降解信號(hào)（C-degron），可以被Cullin-RING E3泛素連接酶（CRLs）復(fù)合體中不同的底物受體所識(shí)別，包括KLHDC2, FEM1A/1C, FEM1B以及APPBP2等。之前的工作中，許超教授課題組通過(guò)解析FEM1B、FEM1C與Arg/C-degron小肽的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，揭示了CRL2FEM1通過(guò)識(shí)別Arg/C-degron調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。而APPBP2作為CRL2的另一種底物受體，已被證明能識(shí)別底物羧基末端Arg-x-x-Gly基序（R-x-x-G/C-degron）并介導(dǎo)底物的降解，然而，其中的分子機(jī)制仍然是未知的。

研究人員體外純化組裝了CRL2APPBP2與三種不同R-x-x-G/C-degron小肽結(jié)合的復(fù)合物（圖1），包括XP_211896（L-T-R-N-K-G-P）、XP_211896的變體（L-T-R-N-K-G-P-A-A）和MRPL28（Q-K-R-A-S-G-Q），通過(guò)冷凍電鏡分別解析其原子分辨率結(jié)構(gòu)。

圖1：CRL2APPBP2二聚體與R-x-x-G-P/C-degron復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)分析表明，所有C-degron小肽結(jié)合在由APPBP2的TPR repeats 6-11所組成的一個(gè)深的口袋中，C-degron序列中的Gly和Arg分別被APPBP2口袋中的窄溝槽以及帶負(fù)電的表面所識(shí)別（圖2）。另外，APPBP2殘基與XP_211896 C-degron的Arg-5、Asn-4和Lys-3的主鏈氫鍵網(wǎng)絡(luò)賦予了-5RNKG-2基序剛性，從而闡明了C-degronArg和Gly之間需要間隔兩個(gè)殘基（R-x-x-G）的機(jī)理。此外，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明R-x-x-G在C-degron序列中的位置具有一定可塑性，R-x-x-G羧基端加入1-3個(gè)殘基不影響與APPBP2結(jié)合。

圖2：APPBP2識(shí)別R-x-x-G/C-degron的分子機(jī)制

研究人員利用突變、等溫滴定量熱（ITC）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證APPBP2與R-x-x-G/C-degron作用界面，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞內(nèi)基于雙熒光的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性報(bào)告系統(tǒng)（GPS）揭示R-x-x-G/C-degron通過(guò)招募CRL2APPBP2介導(dǎo)綠色熒光蛋白質(zhì)降解。以上研究不僅解析了CRL2APPBP2識(shí)別R-x-x-G/C-degron的分子機(jī)制，而且為未來(lái)設(shè)計(jì)靶向CRL2APPBP2的小分子抑制劑和PROTAC分子提供了基礎(chǔ)。