預(yù)防利器甚至治療希望——帶你了解狂犬病毒單克隆抗體的前世今生

想了很多種開場，想讓讀者們能夠像是聽到評書演員拍響手中那塊醒木的清脆聲音一樣，能夠?qū)㈥P(guān)注點迅速吸引到這篇文章當(dāng)中，但考慮到本文除了「理論性」也需要兼顧一些「實用性」，因此，結(jié)合前不久剛發(fā)布的《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范(2023年版)》內(nèi)容，用一張圖表展示狂犬病「疫苗」和「被動免疫制劑」的應(yīng)用方法。

接下來，我們回歸主題，聊聊狂犬病和已經(jīng)或即將被批準(zhǔn)的狂犬病毒「單克隆抗體」。

【狂犬病的歷史趣談】

人類發(fā)現(xiàn)狂犬病的存在，比人類開始馴化犬只，大約晚了至少10000年的時間——約在4000年前才出現(xiàn)記載了狂犬病的信息。
人們發(fā)現(xiàn)狂犬病后，由于當(dāng)時科技和水平的限制，并沒有辦法理解狂犬病的發(fā)病機制——甚至有人認(rèn)為被瘋狗咬的人是遭到了「狗的詛咒」。 （狂犬病古跡，圖源文獻(xiàn)）
不過值得稱贊的是，在有些「詛咒」中，明確提到人們**「狂犬病是由受感染動物唾液中存在的某種物質(zhì)」引起的。
當(dāng)然，也有的認(rèn)為「當(dāng)年底發(fā)生月食時，狗更有可能患狂犬病」。
那么既然認(rèn)為是詛咒，治療方法是什么呢？當(dāng)然就是「用神話打敗神話」了。
于是被瘋狗咬傷的人們有的會采用草藥進(jìn)行治療，有的人則直接或在草藥治療失敗后求助于神靈或者神父，讓他們使用「咒語」治療狂犬病。
雖然這些行為看上去很可笑，但更可笑的還在后面。
隨著時間推移，人們對狂犬病的認(rèn)知逐漸加深，預(yù)防和治療狂犬病的方法也如同雨后春筍一樣出現(xiàn)。
在預(yù)防方面，《波斯古經(jīng)》就提到建議人們讓疑似患有狂犬病的狗咬從而預(yù)防狂犬?。ǖ故欠厦庖邔W(xué)基本原理）；也有記載牧羊人「將40天大的小狗尾巴剪斷」，以避免其被別的感染狂犬病病毒的動物咬傷從而避免患?。ㄒ菜闶呛侠恚?。
但在治療**方面就非常搞笑了——比如用燒紅的的「圣·休伯特的鑰匙」炙烤傷口、切開被狗咬傷者的前額并在傷口內(nèi)植入「圣徒披肩」的線、將人「泡在水里或熱油中」、把咬人的「狗腦子取出來敷在傷者的傷口上」等。

圣·休伯特的鑰匙（Clef de Saint-Hubert），圖源網(wǎng)絡(luò)
所幸的是，這些奇奇怪怪的防治方法僅僅到了19世紀(jì)就基本蕩然無存了，或許現(xiàn)在更值得關(guān)注的是——狂犬病疫苗到底是怎么被發(fā)明出來的，以及……
柯基沒有尾巴的小圓屁股和剛才說的預(yù)防方式有沒有關(guān)系。
【疫苗的發(fā)明與誤解】

說到狂犬病疫苗，就不得不提到一個和牛奶相關(guān)的專業(yè)詞匯——巴氏滅菌法（或許更多人聽過的是**「巴氏消毒法」）。
當(dāng)然，重點不是這種讓巴氏奶進(jìn)入千家萬戶的工藝，而是其發(fā)明人，享有「細(xì)菌學(xué)之父」、「微生物學(xué)之父」之稱的法國科學(xué)家——路易斯·巴斯德（lwi past??）。
在家喻戶曉的故事中，巴斯德率先發(fā)明了全世界第一個狂犬病疫苗**，并且采用這種疫苗拯救了一名名叫約瑟夫·邁斯特的被瘋狗嚴(yán)重咬傷的兒童，撰寫了狂犬病疫苗的「開山之作」。
但在2022年——巴斯德誕辰200周年——發(fā)布的一篇文獻(xiàn)中，很多有關(guān)狂犬病疫苗的信息被大量披露出來，讓人們知道這名科學(xué)家并不像大家耳熟能詳?shù)哪切┕适轮心菢油昝馈?br /> 事實上，在巴斯德出生之前的16到18世紀(jì)，包括意大利醫(yī)生吉羅拉莫·弗拉卡斯托羅（Girolamo Fracastoro）、英國醫(yī)生馬丁·李斯特（Martin Lister）、蘇格蘭外科醫(yī)生約翰·亨特（John Hunter）在內(nèi)的多名科學(xué)家都準(zhǔn)確描述部分狂犬病的病因或傳播途徑，遺憾的是都沒有提出「病毒」的概念。
在19世紀(jì)，一名叫做弗朗索瓦·馬讓迪（Fran?ois Magendie）的法國生理學(xué)家提出，狂犬病是一種由能夠在體內(nèi)生長和繁殖的「病毒」導(dǎo)致的。
全世界第一個發(fā)明狂犬病疫苗（非人用）的人是法國里昂醫(yī)學(xué)院教授皮埃爾·維克多·加爾捷（Pierre-Victor Galtier），他不僅發(fā)現(xiàn)了「狗能將狂犬病毒傳染給兔子」，并且成功通過其制備的疫苗免疫了「9只綿羊」和「1只山羊」。
皮埃爾·維克多·加爾捷，圖源：二手書網(wǎng)站
但遺憾的是，此后他并沒有成為第一個成功研制出「人用狂犬病疫苗」的人。
相比較之下，巴斯德的成功可以說是得到了貴人的扶持。
在最開始的研究中，此前已經(jīng)成功制備出多種細(xì)菌疫苗的巴斯德根本沒能在狂犬病疫苗研究上獲得進(jìn)展，但隨著微生物研究員皮埃爾-亨利·杜布埃（Pierre-Henri Duboué）將自己對于狂犬病毒在神經(jīng)傳播中的成果寄給了巴斯德，并且巴斯德的助手埃米爾·魯（Emile Roux）基于上文提到的皮埃爾-維克多·加爾捷的研究成果制備了「動物模型」（兔子），最終巴斯德團隊的研究團隊才制作出了真正的「人用狂犬病疫苗」。
而他們制作的狂犬病疫苗，在為后來成為巴斯德研究所門衛(wèi)的約瑟夫·邁斯特注射之前，已經(jīng)有了一次成功和一次失敗的例子，并且由于給約瑟夫·邁斯特的疫苗是一種采用全新的脊髓干燥法且「未經(jīng)動物試驗」的制品，埃米爾·魯拒絕幫助沒有行醫(yī)資格的巴斯德給約瑟夫·邁斯特注射，最后還是另一位名叫約瑟夫·格蘭徹（Joseph Grancher）人給孩子打的。
巴斯德被形容為與狂犬病作斗爭的天使，圖源文獻(xiàn)

所幸的是，這次疫苗「似乎是有效的」，而巴斯德也通過宣布了狂犬病疫苗的成功再一次成為了全世界的焦點。
遺憾的是，這種疫苗獲準(zhǔn)使用后，仍出現(xiàn)了多人在被瘋狗咬傷后注射疫苗后出現(xiàn)狂犬病最終死亡的案例，死者中甚至還有勛爵。
在巴斯德的疫苗應(yīng)用多年后，羅馬衛(wèi)生研究所的醫(yī)生克勞迪奧·費米（Claudio Fermi）對這種疫苗的有效性提出質(zhì)疑，并采用苯酚處理狂犬病病毒并發(fā)明了更安全且有效的疫苗——研究發(fā)現(xiàn)，巴斯德的疫苗對兔子的保護效果「僅為35%」，而費米的疫苗保護效果則高達(dá)77.7%。
即便如此，巴斯德的狂犬病毒疫苗確實被證實有保護效果，要知道，在巴斯德之前并沒有任何人發(fā)明出「有效的」人用狂犬病疫苗。
盡管有人用「不公、傲慢、傲慢、輕蔑、教條、沉默寡言、個人主義、專制、野心家、阿諛奉承、貪婪、對對手無情」等詞匯形容路易斯·巴斯德，但不可否認(rèn)的是，就是這樣一個具有大量缺點的人，讓全世界真正開始向消滅狂犬病的大目標(biāo)邁進(jìn)。
有了基礎(chǔ)，未來的狂犬病疫苗會是什么樣？我們拭目以待。

【被動免疫制劑進(jìn)展】

盡管狂犬病疫苗已經(jīng)獲得成功，而且隨著技術(shù)進(jìn)步，疫苗的安全性和有效性也隨之提高，但由于狂犬病的潛伏期可以「短至1周以內(nèi)」，單獨使用狂犬病疫苗的起效速度仍還不夠「快」，于是另外一種預(yù)防狂犬病的生物制品誕生了——「被動免疫制劑」。
被動免疫制劑是一種含有能夠中和細(xì)菌毒素或者病毒的抗體制品，不像疫苗需要在接種后通過免疫反應(yīng)生成抗體（和/或誘導(dǎo)足夠的細(xì)胞免疫）才能夠發(fā)揮作用，而是注射到體內(nèi)后就能**「立刻」發(fā)揮作用。
1890年，德國生理學(xué)家埃米爾·馮·貝林（Emil von Behring）發(fā)表的文章稱其發(fā)現(xiàn)了白喉和破傷風(fēng)的「抗毒素」，并因此白喉抗毒素獲得了1901年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
最初的這種白喉和破傷風(fēng)抗毒素來自于「接種了白喉類毒素后獲得免疫力」的豚鼠、山羊和「馬」的體內(nèi)，馮·貝林發(fā)現(xiàn)這些動物的血清可以用來預(yù)防或治療相關(guān)疾病**。
采集抗白喉毒素的馬，圖源文獻(xiàn)
幾乎與此同時，羅馬尼亞細(xì)菌學(xué)家維克多·巴貝斯（Victor Babes）等人于1891年通過實驗證明了**「抗狂犬病毒血清」對動物的保護作用。
此外，做出了比巴斯德的人用狂犬病疫苗有效性更高疫苗的羅馬醫(yī)生克勞迪奧·費米在人類身上注射了狂犬病抗血清，以阻斷病毒在咬傷傷口中的復(fù)制。在研究的支持下，使用「狂犬病特異性免疫球蛋白」（馬血清）配合疫苗預(yù)防狂犬病在20世紀(jì)50年代得到了推廣。
盡管馬血清和狂犬病疫苗一起使用，能夠顯著提高被狂犬病動物嚴(yán)重咬傷后的生存機會，但隨著馬血清的應(yīng)用和普及，人們發(fā)現(xiàn)了一個非常嚴(yán)重的問題——馬血清太容易導(dǎo)致「過敏」了！
不僅如此，研究還發(fā)現(xiàn)，馬血清和狂犬病疫苗一起使用還可能影響疫苗免疫原性，并且世界衛(wèi)生組織專門還專門提出過同時使用馬血清和疫苗后的「疫苗加強免疫」建議。
曾經(jīng)的狂犬病疫苗加強方案，圖源文獻(xiàn)
因此，有效、不會干擾疫苗效果、更安全的被動免疫制劑研發(fā)，就被科學(xué)家們提上了日程。
動物不行，那就用「人」。
此前用于制備馬血清的馬就像是一個大型的抗體培養(yǎng)皿，而人源性的抗體制品就是把馬換成了人，通過提取接種過狂犬病疫苗的人體內(nèi)的血清，制造出了更加安全的「人源免疫球蛋白」。
這種方式取得了成功——在研究中發(fā)現(xiàn)，10國際單位/公斤的用量會導(dǎo)致抗體水平不足、40國際單位/公斤的用量會干擾疫苗效果，于是最終采用了「20國際單位/公斤」的方案，并且發(fā)現(xiàn)人源免疫球蛋白比馬血清效力更高。
然而，人源免疫球蛋白和馬血清仍然存在兩個問題：1.制備成本高；2.無法100%規(guī)避其他病原體（比如「艾滋病病毒」）污染的潛在風(fēng)險。
最新的、能夠解決上述兩個問題的狂犬病被動免疫制劑名字叫做「單克隆抗體」**。
【單克隆抗體的意義】

無論是馬血清還是人源免疫球蛋白，其實主要的有效成分都是「抗體」。
那么，我們?yōu)槭裁催€要拿馬或者人做抗體溶液的發(fā)酵罐？直接在體外合成針對狂犬病病毒的抗體不就好了？
事實上，這個方案非?！缚尚小埂?br /> 當(dāng)科學(xué)已經(jīng)能夠闡明抗體是由B細(xì)胞接觸抗原信息激活后分化為「漿細(xì)胞」所生成的之后，人們首次通過融合免疫后的小鼠脾臟中的B細(xì)胞（粗暴理解為已經(jīng)被激活）與骨髓瘤細(xì)胞融合制備成雜交瘤細(xì)胞，讓這些能夠分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞在體外源源不斷地制造**「單克隆抗體」。
早期單克隆抗體制備示意圖
單克隆抗體制備隨著技術(shù)的發(fā)展也逐漸從「動物源」向「人源化」發(fā)展**，以盡可能降低單克隆抗體中非人類序列的存在。
既能獲得能夠有效抵御病毒的高純度單克隆抗體，又能降低生產(chǎn)成本，同時還能規(guī)避動物源性血清中存在被其他病原體污染的風(fēng)險，那這種單克隆抗體技術(shù)是否能夠用于狂犬病的預(yù)防領(lǐng)域呢？
不僅是「預(yù)防」，還有「檢測」甚至「治療」！
在狂犬病的（暴露后）預(yù)防方面，和其他被動免疫制劑一樣，狂犬病單克隆抗體也被寄予厚望，但由于單克隆抗體存在一個巨大的「風(fēng)險」——成分相對于馬血清和人免疫球蛋白更加「單一」！
這個風(fēng)險代表什么呢？那就是被逃逸。
在新冠大流行的幾年中，我們知道RNA病毒具有易突變的特點，雖然狂犬病病毒很穩(wěn)定，但也存在多種不同亞型和分支，因此如果采用**「單一一種單克隆抗體」成分，那么一旦這種單克隆抗體所對應(yīng)的靶位突變，那么就意味著這種單克隆抗體可能會失效。
研制的單克隆抗體（兩種單組分的已獲批上市），圖源文獻(xiàn)
要知道，狂犬病的病死率接近100%，如果被動免疫制劑失效、疫苗還沒來得及起效，那么被感染者所面臨的或許就只有「死亡」。
那如何規(guī)避這種情況發(fā)生呢？兩種方案：①篩選出能夠中和不同亞型狂犬病病毒的「廣譜單克隆抗體」；②采用兩個靶向表位不重疊的單克隆抗體進(jìn)行組合以「覆蓋更多病毒抗原表位」。
從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)來看，目前在印度和中國已獲批的兩種狂犬病單克隆抗體，均能滿足第①的要求，但均未符合世界衛(wèi)生組織（WHO）立場文件中提到的「開發(fā)含有2種或2種以上具有不重疊表位的單克隆抗體的產(chǎn)品將提高中和狂犬病病毒的有效性和范圍」建議。
不過好消息是，國內(nèi)即將上市「全球首個」同時滿足①和②的狂犬病單克隆抗體制品，而這將會是一款「基本消除此前所有已獲批狂犬病被動免疫制劑「理論風(fēng)險」的新產(chǎn)品。
名為SYN023（CTB011/CTB012）的單克隆抗體組合，圖源網(wǎng)絡(luò)
另外，在檢測領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出更具特異性狂犬病單克隆抗體，這種單克隆抗體能夠幫助人們「獲得更加精準(zhǔn)的檢測結(jié)果」。
印度的一項研究采用兩種單克隆抗體組合成功「治愈」了一只「此前感染狂犬病病毒」的小鼠，在被治療的小鼠體內(nèi)完全無法檢測到病毒存在**！
因此，狂犬病單克隆抗體存在的意義，已經(jīng)不僅限于此前的被動免疫制劑只能用于暴露后預(yù)防的定位，而是具有更廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。
在未來，單克隆抗體能攻克狂犬病嗎？至少我們目前看到了希望。希望有朝一日，狂犬病能夠被徹底攻克，讓這種病的患者不再面對幾乎必死的結(jié)果。

更希望我國能夠?qū)崿F(xiàn)**“2030年消滅人類狂犬病”**的目標(biāo)，狂犬病疫苗最終都能夠用在狗身上，而不是源源不斷地扎在人身上，甚至扎在不必要的人身上。

參考資料：

1. Tarantola, Arnaud. “Four Thousand Years of Concepts Relating to Rabies in Animals and Humans, Its Prevention and Its Cure.” Tropical medicine and infectious disease vol. 2,2 5. 24 Mar. 2017, doi:10.3390/tropicalmed2020005

2. Cavaillon, Jean-Marc, and Sandra Legout. “Louis Pasteur: Between Myth and Reality.” Biomolecules vol. 12,4 596. 18 Apr. 2022, doi:10.3390/biom12040596

3. Natesan, Krithiga et al. “Developments in Rabies Vaccines: The Path Traversed from Pasteur to the Modern Era of Immunization.” Vaccines vol. 11,4 756. 29 Mar. 2023, doi:10.3390/vaccines11040756

4. Ragu, Tonse NK. "The Nobel Chronicles." The Lancet 352.9135 (1998): 1232-1232.

5. Graham, Barney S, and Donna M Ambrosino. “History of passive antibody administration for prevention and treatment of infectious diseases.” Current opinion in HIV and AIDS vol. 10,3 (2015): 129-34. doi:10.1097/COH.0000000000000154

6. HOSTY, T S et al. “Human antirabies gamma globulin.” Bulletin of the World Health Organization vol. 20,6 (1959): 1111-9.

7. Atanasiu, P et al. “Rabies neutralizing antibody response to different schedules of serum and vaccine inoculations in non-exposed persons. 4.” Bulletin of the World Health Organization vol. 36,3 (1967): 361-5.

8. Cabasso, V J. “Rabies immune globulin (human) in the prevention of rabies.” American journal of hospital pharmacy vol. 33,1 (1976): 48-51.

9. Bharti, Omesh Kumar et al. “Injecting rabies immunoglobulin (RIG) into wounds only: A significant saving of lives and costly RIG.” Human vaccines & immunotherapeutics vol. 13,4 (2017): 762-765. doi:10.1080/21645515.2016.1255834

10. Liu, Justin K H. “The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.” Annals of medicine and surgery (2012) vol. 3,4 113-6. 11 Sep. 2014, doi:10.1016/j.amsu.2014.09.001

11. Tabll, Ashraf et al. “Monoclonal antibodies: Principles and applications of immmunodiagnosis and immunotherapy for hepatitis C virus.” World journal of hepatology vol. 7,22 (2015): 2369-83. doi:10.4254/wjh.v7.i22.2369

12. Kaunitz, Jonathan D. “Development of Monoclonal Antibodies: The Dawn of mAb Rule.” Digestive diseases and sciences vol. 62,4 (2017): 831-832. doi:10.1007/s10620-017-4478-1

13. Chander, Vishal et al. “Development of monoclonal antibodies suitable for rabies virus antibody and antigen detection.” Indian journal of virology : an official organ of Indian Virological Society vol. 23,3 (2012): 317-25. doi:10.1007/s13337-012-0096-x

14. World Health Organization. "Rabies vaccines: WHO position paper, April 2018–Recommendations." Vaccine 36.37 (2018): 5500-5503.

15. Chander, Vishal et al. “Development of monoclonal antibodies suitable for rabies virus antibody and antigen detection.” Indian journal of virology : an official organ of Indian Virological Society vol. 23,3 (2012): 317-25. doi:10.1007/s13337-012-0096-x

16. de Melo, Guilherme Dias et al. “A combination of two human monoclonal antibodies cures symptomatic rabies.” EMBO molecular medicine vol. 12,11 (2020): e12628. doi:10.15252/emmm.202012628

17. 國家疾控局綜合司. "狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范." 2023.

18. 周航等. "狂犬病預(yù)防控制技術(shù)指南(2016版)." 中華流行病學(xué)雜志 37.2(2016):25.