[科普中國]-第二代DNA測序技術(shù)

第二代DNA測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù)，是對第一代測序技術(shù)的劃時代變革的核心?，F(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScope? Single Molecule Sequencer、美國Dana-her Motion公司推出的Polonator；以及連接法測序 (sequencing by ligation)，即通過引物來定位核酸信息，技術(shù)平臺有Applied Biosystems/SOLiD? system。以上技術(shù)平臺所運用的測序原理均為循環(huán)微陣列法1。

背景DNA測序技術(shù)長期以來，DNA測序技術(shù)一直是分子生物學(xué)相關(guān)研究中最常用的技術(shù)手段之一，從一定程度上推動了該領(lǐng)域的快速發(fā)展。人類基因組計劃、轉(zhuǎn)錄組分析、微生物基因組重測序、單核苷酸的多態(tài)性 (single nucleotide polymorphisms,SNP) 分析等方面也促進的其他生物學(xué)領(lǐng)域的研究和發(fā)展。每一代測序技術(shù)的更替都標(biāo)志著生物學(xué)中基因芯片、數(shù)據(jù)分析、表面化學(xué)、生物工程等技術(shù)領(lǐng)域有了新的突破，從而應(yīng)用在了測序領(lǐng)域，大大降低了測序成本，提高了測序效率，使測序向著高通量、低成本、高安全性和商業(yè)化的方向發(fā)展1。

第一代DNA測序盡管第一代 DNA 測序技術(shù)以其可達 1000 bp 的測序讀長、99.999% 的高準(zhǔn)確性幫助人們完成了大量的測序工作，但其測試速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也致使其不能得到大眾化的應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的進步以及科研人員對測序技術(shù)的努力開發(fā)，2005 年 Roche 公司發(fā)布的 454 測序系統(tǒng)標(biāo)志著測序技術(shù)跨人高通量并行測序的時代。第二代 DNA 測序技術(shù)又稱大量并行測序技術(shù) (massive parallel sequencing,MPS)、高通量測序技術(shù)(high—throughput sequencing,HTS)，以低成本、99% 以上的準(zhǔn)確度，1次可對幾百、幾千個樣本的幾十萬至幾百萬條 DNA 分子同時進行快速測序分析。這一時期的代表技術(shù)有 Roche 公司的 454、Illumina公司的 Solexa、ABI公司的SOLID，由于該時期的測序技術(shù)十分前沿，因而市場主要被這三家公司所壟斷2。

基本平臺454焦磷酸法平臺454焦磷酸法平臺是最早上市的循環(huán)微陣列法平臺，使用的是邊合成邊測序 (sequencing by synthesis, SBS)技術(shù)，避免了Sanger法存在的宿主菌克隆問題3。

①首先將待測的目的DNA分子打斷成 300-800 bp 的片段，然后在 DNA 片段的 5′ 端加上一個磷酸基團，3′ 變成平端，在兩端分別加上 44 bp 的 A、B 兩個銜接子，組成目的 DNA 的樣品文庫。加上這樣兩個銜接子 A、B 的目的是為了其在生物素和鏈霉親和素的作用下，同含有過量鏈霉親和素的磁珠特異性結(jié)合3。

②目的 DNA 片段固定到一個磁珠上之后，將磁珠包被在單個油水混合小滴(乳滴)，在這個乳滴里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響，從而實現(xiàn)了所有目的 DNA 片段進行平行擴增乳滴 PCR (emul-sion PCR, emPCR)，經(jīng)過富集之后，每個磁珠上都有約 107 個克隆的 DNA 片段3。

③隨后將這些DNA片段放入 PTP(Pico TiterPlate) 反應(yīng)板中進行后繼測序。PTP平板含有 160 多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物3。

④測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照 T、A、C、G 的順序依次循環(huán)進入 PTP 板，每次只進入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸鹽 (inorganic pyrophosphate, PPi) 分子。PPi 在ATP硫酸化酶的催化下與腺苷酰硫酸反應(yīng)生成 ATP，ATP 與蟲螢光素反應(yīng)發(fā)光，光信號的最大波長約為 560 nm3。

⑤此反應(yīng)釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度 CCD 捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號，由此一一對應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列，讀長可達到近 500 bp3。

Solexa基因組分析儀Solexa 分析儀通常也被稱為 Illumina 測序儀，所使用的方法是克隆單分子陣列技術(shù)3。

①將目的DNA分子打斷成 100-200 bp 的片段，隨機連接到固相基質(zhì)上，經(jīng)過 Bst 聚合酶延伸和甲酸胺變性的橋PCR循環(huán)，生成大量的 DNA簇 (DNA cluster)，每個DNA 簇中約有1000個相同序列的 DNA 片段3。

②之后的反應(yīng)與Sanger法類似，加入用4種不同熒光標(biāo)記并結(jié)合了可逆終止劑的 dNTP。固相基質(zhì)上每個孔有八道獨立檢測的位點，所以一次可以并行八個獨立文庫，可容納數(shù)百萬的模版克隆，可把多個樣品混合在一起檢測，每個固相基質(zhì)上一次可讀取10億個堿基3。

③DNA 簇與單鏈擴增產(chǎn)物的通用序列雜交，由于終止劑的作用，DNA 聚合酶每次循環(huán)只延伸一個 dNTP。每次延伸所產(chǎn)生的光信號被標(biāo)準(zhǔn)的微陣列光學(xué)檢測系統(tǒng)分析測序，下一次循環(huán)中把終止劑和熒光標(biāo)記基團裂解掉，然后繼續(xù)延伸 dNTP，實現(xiàn)了邊合成邊測序技術(shù)3。

④其主要的缺點是由于光信號衰減和移相的原因使得序列讀長較短，可以進行每個 DNA 測序片段的閱讀長度僅為 75 bp 的末端雙向測序反應(yīng)3。

SOLiD高通量測序儀SOLiD(sequencing by oligonucleotideligationand detection, SOLiD)測序技術(shù)最初是由哈佛大學(xué) Church 研究小組成員Shendure等所發(fā)明的。Church 研究組發(fā)明的方法的一部分授權(quán)給了 Agen-court 公司，并在 2006年7月被美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (Applied Biosystems lnc, ABI) 收購，組建 SOLiD 測序平臺?；谠撛淼淖钚聹y序平臺是于2010年末推出的5500xl，已是第五代產(chǎn)品3。

①首先制備 DNA 文庫。SOLiD 技術(shù)支持兩種測序文庫，分別是片段文庫(fragment library)和配對末端文庫(mate-paired library)。將待測的DNA分子打斷，并在兩端加上接頭，則可組成片段文庫。而配對末端文庫則是先把DNA分子打斷，在中間加入 EcoP15 酶切位點和internal接頭后進行環(huán)化，然后用 EcoP15 酶切，使得接頭的兩端各有27 bp的堿基，最后在兩端加上接頭，構(gòu)成文庫，適用于全基因組測序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排及拷貝數(shù)的分析等相關(guān)領(lǐng)域4。

②第二個階段與454焦磷酸測序法相同，加入磁珠等反應(yīng)元件進行 emPCR 平行擴增，不同的是該方法的磁珠只有1 μm。在連接測序中，底物是 8 個堿基的八聚體單鏈熒光探針，在5′末端分別標(biāo)記了CY5、Teaxs Red、CY3、6-FAM這四種顏色的熒光染料。3′ 端的第 1、2 位堿基類別排序分別對應(yīng)著一個固定的熒光染料，第 3、4、5 位堿基“n”是隨機堿基，第 6、7、8 位堿基“z”是可以和任何堿基配對的特殊堿基3。

③一次測序中包括了五輪連接反應(yīng)。每輪連接反應(yīng)首先是由3個堿基“n”介導(dǎo)，將八聚體連接在引物上，測序儀記錄熒光染料信號，然后斷裂掉堿基“z”，準(zhǔn)備連接下一個八聚體。一次循環(huán)后，將引物重置，進行第二輪連接反應(yīng)，反應(yīng)位置比前一輪錯開一位，這樣引物上的每個堿基都會有兩次與第1、2位的相連接，顯著減小了測序誤差 3。

HeliScope測序儀HeliScope 測序儀是由 Quake 團隊設(shè)計開發(fā)的，從原理層面上來看，屬于第二代測序原理，是循環(huán)芯片測序儀的一種。但是其在第二代的基礎(chǔ)上引入了單分子測序的概念，被稱為2.5代。

①該方法克服了第二代測序技術(shù)中需要用 PCR 擴增來增強熒光信號這一技術(shù)難題，采用了更加靈敏的圖像傳感器 (charge-coupled device, CCD) 可以出檢測單分子 dNTP 攜帶的熒光基團發(fā)出的信號，單次掃描時間只有 15 ms 5。

②HeliScope利用精密的全內(nèi)反射顯微鏡 (total internal reflection microscopy) 技術(shù)，在測序結(jié)束后去掉延伸的合成鏈，從相反的方向再進行另一次測序，生成同一模板的第二個序列信息，雙向測序顯著提高了原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度 3。

③HeliScope 測序儀和 454 測序儀一樣，測序是不同步完成的，而測序速度由每條模版的序列來確定。由于大量的未標(biāo)記堿基、不發(fā)光堿基和污染堿基的滲入，檢測確實突變的出錯率較高，但檢測堿基替換突變的誤差率較低3。

本詞條內(nèi)容貢獻者為:

江松敏 - 副教授 - 復(fù)旦大學(xué)