[科普中國(guó)]-雜種耬斗菜

多年生草本。二回三出復(fù)葉，最終小葉或裂片廣楔形。夏季開(kāi)花，花生于枝頂，青色，紫色或白色，花瓣五片，各有一彎曲的距。果實(shí)被稠密的短絨毛。別名：血見(jiàn)愁、貓爪花；原產(chǎn)歐洲。栽培供觀賞。以全草入藥。夏季采收，洗凈切碎，熬煎至濃縮成膏用。性味歸經(jīng)：苦、微甘，平。功能主治：調(diào)經(jīng)止血。用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)期腹痛，功能性子宮出血，產(chǎn)后流血過(guò)多。1

相關(guān)耬斗菜因其表型的多樣性、生境分布的廣泛性、材料遺傳操作性強(qiáng)被廣泛應(yīng)用于進(jìn)化、分子遺傳育種學(xué)研究2。本文對(duì)耬斗菜屬以下三個(gè)方面進(jìn)行綜述,以期為本屬植物和相關(guān)分子遺傳學(xué)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù):(1)物種進(jìn)化和生殖生態(tài):耬斗菜屬的花距的變長(zhǎng)是由于一系列可以預(yù)測(cè)的、針對(duì)不相關(guān)的授粉者的適應(yīng)性變化,傳粉者的轉(zhuǎn)變可能是導(dǎo)致耬斗菜屬距長(zhǎng)進(jìn)化的誘因。(2)雜交育種:耬斗菜屬中最有價(jià)值的雜交種產(chǎn)生于A.coerulea和A.chrysantha之間,區(qū)分種類的性狀有些由主基因控制,而有些由微基因控制。(3)花色的分子遺傳學(xué):耬斗菜屬內(nèi)存在豐富的花色變異,對(duì)耬斗菜屬中開(kāi)展的關(guān)于花青素苷合成的生化途徑的分析、雜交實(shí)驗(yàn)和基因表達(dá)分析等為研究耬斗菜花色的遺傳基礎(chǔ)提供了寶貴信息2。

耬斗菜(Aquilegia viridiflora)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)耬斗菜屬(Aquilegia),該屬共包括70多個(gè)物種,廣泛分布于北半球溫帶地區(qū)。我國(guó)大概分布有13個(gè)耬斗菜屬物種,其中耬斗菜是分布比較廣泛的物種之一3。本實(shí)驗(yàn)選取了耬斗菜這個(gè)物種內(nèi)的7個(gè)自然居群作為研究對(duì)象。這些自然群體廣泛分布于我國(guó)的東北與華北地區(qū),并在花的形態(tài)和顏色方面存在顯著差異。為了研究該物種的遺傳結(jié)構(gòu),我們運(yùn)用了單拷貝核基因標(biāo)記的方法對(duì)耬斗菜這7個(gè)自然居群共計(jì)100個(gè)個(gè)體的三個(gè)核基因(ADH,OGGA,gEST-8)和十個(gè)葉綠體基因(trnD-psbM、matK、ndhJ-trnF ndhC-trnV、Ycf6-psbM、rps12-rp120、atpH-atpL、ndhA、trnC-ycf6和trnC-rpoB)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析3。根據(jù)所獲得的數(shù)據(jù),我們進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)(Genetic structure)、單倍型網(wǎng)絡(luò)支系圖(Haplotype network)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Phylogenetic tree)等相關(guān)方面的分析。根據(jù)遺傳多樣性結(jié)果分析顯示,該物種的各個(gè)居群都具有較高的遺傳多樣性(Genetic diversity)。單倍型網(wǎng)絡(luò)支系結(jié)果顯示該物種內(nèi)各居群間的單倍型在各個(gè)地區(qū)的比例差異并不明顯。此外,根據(jù)遺傳分化分析顯示,耬斗菜物種內(nèi)各居群間出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化。綜合以上所有結(jié)果,耬斗菜各居群間的花在形態(tài)顏色上已出現(xiàn)了較為顯著的差別,同時(shí)在遺傳水平上也出現(xiàn)了一定程度的分化?；谶@些結(jié)果,我們初步推斷導(dǎo)致該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是不同的居群在進(jìn)化的過(guò)程中在地理隔離作用下的遺傳漂變以及不同自然環(huán)境下的選擇壓力使它們逐漸產(chǎn)生了表型與遺傳分化3。

耬斗菜(Aquilegia viridiflora pall)為毛莨科耬斗菜屬多年生草本植物,全草入藥,是蒙古族民間藥食兩用植物。一般5-6月份可以采集其嫩莖葉作為野生蔬菜食用,具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),7-8月份采摘晾干入藥,具有調(diào)經(jīng)止血、清熱解毒、治傷、止痛等作用。耬斗菜在內(nèi)蒙古地區(qū)分布廣泛,在民間使用歷史悠久,易于采摘,易于辨認(rèn)4,本研究將在前人的研究基礎(chǔ)上主要補(bǔ)充及分析耬斗菜的有效成分含量及隨著采摘時(shí)期的變化和生物堿的結(jié)構(gòu)鑒定。本研究以蒙古族藥食兩用植物耬斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)為材料,測(cè)定不同采摘時(shí)期的生物堿含量、黃酮含量、維生素C含量、蛋白質(zhì)含量以及不同生長(zhǎng)時(shí)期的總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-P X)含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)含量和總超氧化物歧化酶(T-SOD)含量,并對(duì)上述各項(xiàng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化分析；測(cè)定耬斗菜乙醇提取物對(duì)黑腹果蠅壽命的影響及其體內(nèi)CAT, SOD和丙二醛(MDA)含量的影響；設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)探索提取分離耬斗菜總生物堿的最佳工藝條件；用高效氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù),對(duì)耬斗菜總生物堿進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。通過(guò)本研究,豐富和完善耬斗菜有效成分的研究?jī)?nèi)容為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),讓耬斗菜發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值,揭示有效成分的季節(jié)性變化規(guī)律,為合理的采收,保護(hù)民族藥食兩用植物資源提供科學(xué)思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)4。研究結(jié)果如下；1耬斗菜代謝物含量的動(dòng)態(tài)研究耬斗菜采摘時(shí)間為2014年的5月13日、6月5日、6月28日、7月21日、8月13日。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),耬斗菜生物堿含量在8月13日時(shí)最高；黃酮含量在6月28日時(shí)最高；蛋白質(zhì)含量在7月21日時(shí)最高；維生素C含量在6月5日時(shí)最高：T-AOC含量在8月13日達(dá)到最高點(diǎn)；T-SOD含量在6月28日時(shí)最高；CAT含量在8月13日時(shí)最高；GSH-PX含量在7月21日達(dá)到最高值。綜合耬斗菜代謝物及酶活性的動(dòng)態(tài)變化研究,發(fā)現(xiàn)在5月初至6月末,耬斗菜中維生素C含量、蛋白質(zhì)含量和黃酮含量都較高,生物堿含量較低,故此時(shí)間段為耬斗菜最佳食用時(shí)期。在7月份和8月份時(shí),生物堿含量富集達(dá)到最高點(diǎn),不宜食用,可進(jìn)行采摘入藥,故此時(shí)間段為耬斗菜的最佳采摘入藥期。2耬斗菜體內(nèi)抗氧化活性的研究用濃度為0.06 mg/100 mg的耬斗菜乙醇提取物喂養(yǎng)雌果蠅和雄果蠅,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組壽命分別延長(zhǎng)了10天和3天,雌果蠅和雄果蠅實(shí)驗(yàn)組平均延壽率是16.32%和5.36%;用0.12 mg/100 mg濃度的耬斗菜乙醇提取物喂養(yǎng)雌果蠅和雄果蠅后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組壽命分別延長(zhǎng)了11天和4天,雌果蠅和雄果蠅實(shí)驗(yàn)組平均的延壽率是18.35%和5.84%4。各濃度組耬斗菜乙醇提取物均能提高雌雄果蠅體內(nèi)CAT、SO D的活性；均能減少M(fèi)DA的含量。3耬斗菜生物堿的提取工藝研究采用熱浸法,以乙醇為溶劑提取耬斗菜總生物堿,對(duì)影響耬斗菜總生物堿提取的四個(gè)主要因素—乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),得出每個(gè)因素最佳的水平,在采用最佳水平的各上下一級(jí)設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn),確立耬斗菜總生物堿的提取工藝。發(fā)現(xiàn)4個(gè)因素對(duì)耬斗菜總生物堿提取率的影響順序?yàn)锽=D>A>C,即浸提溫度=乙醇濃度>浸提時(shí)間>料液比,較優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合為B2D2A2C2,即浸提溫度為70℃、乙醇濃度為80%、浸提時(shí)間為60min、料液比為1：25。44耬斗菜總生物堿的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定耬斗菜乙醇提取液及乙醇超聲波輔助提取液對(duì)生物堿定性試劑均有沉淀反應(yīng),乙醇超聲波輔助提取液對(duì)于改良碘化鉍鉀試劑和Frob de試劑的定性反應(yīng)較乙醇提取物明顯。說(shuō)明乙醇提取液和乙醇超聲波輔助提取液中均含有生物堿,而超聲波輔助提取比單純乙醇溶劑提取法更具有優(yōu)越性。我們從耬斗菜總生物堿乙醇提取液中共分離出2種生物堿,均為希夫堿類化合物,分別是酰腙類希夫堿2,6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙和酰肼類希夫堿2-(3-對(duì)氯苯氧)N-(-2,4二甲氧基芐叉)乙酰肼。綜上所述,通過(guò)對(duì)耬斗菜的基礎(chǔ)性研究,分別確立了耬斗菜的最佳食用和藥用采摘時(shí)間。綜合考慮認(rèn)為,食用耬斗菜時(shí)候選擇生物堿含量較低且蛋白質(zhì)和維生素C含量較高的以6月份為宜,而采摘藥材時(shí)候選擇生物堿含量較高的8月份為宜；耬斗菜乙醇提取物對(duì)黑腹果蠅具有延壽抗衰老作用；耬斗菜總生物堿的最佳提取工藝為：浸提溫度為70℃、乙醇濃度為80%、浸提時(shí)間為60min、料液比為1：25；從耬斗菜乙醇提取物中分離出2種希夫堿類生物堿。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為耬斗菜有效成分的研究及合理的開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)4。