[科普中國(guó)]-保健食品中褪黑素含量的測(cè)定

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以褪黑素為有效成分的膠囊或片劑包裝的保健食品中褪黑素的測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于以褪黑素為有效成分的膠囊或片劑包裝的保健食品中褪黑素的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)第一法高效液相色譜一紫外檢測(cè)法的檢出限為0.5 ng；取樣量0.5 g時(shí)，檢出濃度為0.07 mg/kg。第二法高效液相色譜一熒光法的檢出限為30 pg，線性范圍為0.05 ng～0.50 ng。

第一法高效液相色譜一紫外檢測(cè)法原理試樣中的褪黑素經(jīng)溶解、稀釋、過(guò)濾后，使用具有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀檢測(cè)，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

試劑除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確定為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。

1、甲醇：色譜純。

2、無(wú)水乙醇：優(yōu)級(jí)純。

3、三氟乙酸：優(yōu)級(jí)純。

4、高效液相色譜流動(dòng)相：甲醇+水+三氟乙酸=45+55+0.05。

5、褪黑素(Melatonin)標(biāo)準(zhǔn)品。

6、褪黑素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱量30 mg褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解后定容至刻度。準(zhǔn)確吸取2mL上述溶液于10 mL容量瓶中，加人流動(dòng)相定容至刻度，此溶液濃度為0.060 mg/mL。

儀器設(shè)備1、高效液相色譜儀：附紫外檢測(cè)器。

2、超聲波清洗器。

3、離心機(jī)。

分析步驟1、試樣處理：使用研缽將片劑或膠囊研成粉末并使之混合均勻。

2、精確稱量約一粒片劑或膠囊的質(zhì)量于10 mL容量瓶中，以70%乙醇定容至刻度，使用超聲波清洗器提取10 min。將提取液離心至澄清。準(zhǔn)確量取上清液2 mL于10 mL容量瓶中，以流動(dòng)相定容至刻度，混勻后經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析。

3、測(cè)定

（1）液相色譜參考條件

色譜柱：μ一BondaPak C18，4.6 mm X250 mm。

紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm。

流速：0.8 mL/min。

柱溫：室溫。

（2）色譜分析

量取10μL標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣凈化液注入高效液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

（3）色譜圖

見(jiàn)圖1。

結(jié)果計(jì)算按式(1)計(jì)算：

X=h/hi×c×10×10/2×1000/m

式中：

X——試樣中褪黑素的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；

h——試樣的峰高或峰面積；

hi——標(biāo)準(zhǔn)的峰高或峰面積；

c——褪黑素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)；

m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。

計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的5%。

第二法高效液相色譜熒光法原理試樣中褪黑素經(jīng)甲醇反復(fù)提取，制成甲醇溶液，按一定比例進(jìn)行稀釋后，注入高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離，以熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性和與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比較進(jìn)行定量。

試劑1、甲醇：重蒸。

2、褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.7%。

（1）儲(chǔ)備溶液：精密稱取褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，用甲醇溶解并配成1 g/L的儲(chǔ)備溶液，于一20℃保存。

（2）使用溶液：使用前精密量取一定量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，根據(jù)褪黑素在儀器上的響應(yīng)情況，用甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

儀器1、高效液相色譜儀：附熒光檢測(cè)器和微處理機(jī)。

2、離心機(jī)。

3、超聲波清洗機(jī)。

試樣制備片劑研細(xì)備用；膠囊內(nèi)容物混合均勻備用。

分析步驟1、提取

精密稱取試樣0．2000g于5 mL的刻度試管中，加甲醇約3mL，超聲振蕩10 min，離心，取上清液于10 mL容量瓶中，再加甲醇約3 mL于殘?jiān)?，按前述方法重?fù)提取2次，合并上清液，加甲醇至刻度，搖勻。取此溶液適量，用甲醇稀釋并定容，制成試樣溶液待測(cè)。

2、測(cè)定

（1）高效液相色譜條件

色譜柱：Alltima C18 4.6 mm×250 mm不銹鋼柱。

流動(dòng)相：甲醇。

流速：1 mL/min。

進(jìn)樣量：10μL。

檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)光波長(zhǎng)286 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)352 nm。

（2）色譜分析

將儀器調(diào)至最佳狀態(tài)后，分別將10μL標(biāo)準(zhǔn)溶液及凈化后試樣液注入色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。本方法線范性圍為0.05 ng～0.50 ng。

（3）色譜圖

色譜圖見(jiàn)圖2。

結(jié)果計(jì)算按（2）計(jì)算：

X=m1×V2×1000/m×V1×1000×n

式中：

X——試樣中褪黑素的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；

m1——被測(cè)樣液中褪黑素的含量，單位為納克(ng)；

m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；

V1——樣液進(jìn)樣體積，單位為微升(μL)；

V2——試樣稀釋液總體積，單位為毫升(mL)；

n——稀釋倍數(shù)。

計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%1。