[科普中國(guó)]-超分辨光學(xué)成像

超分辨光學(xué)成像特指分辨率打破了光學(xué)顯微鏡分辨率極限（200nm）的顯微鏡，技術(shù)原理主要有受激發(fā)射損耗顯微鏡技術(shù)和光激活定位顯微鏡技術(shù)。

簡(jiǎn)介光學(xué)顯微鏡憑借其非接觸、無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)是生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具。但是，自1873年以來(lái)，人們一直認(rèn)為，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限約為200 nm，無(wú)法用于清晰觀察尺寸在200 nm以內(nèi)的生物結(jié)構(gòu)。超分辨光學(xué)成像(Super-resolution Optical Microscopy)是本世紀(jì)光學(xué)顯微成像領(lǐng)域最重大的突破，打破了光學(xué)顯微鏡的分辨率極限（換言之，超越了光學(xué)顯微鏡的分辨率極限，故被稱為超分辨光學(xué)成像），為生命科學(xué)研究提供了前所未有的工具。

光學(xué)顯微鏡的分辨率1873年，德國(guó)物理學(xué)家恩斯特·阿貝(Ernst Abbe)提出，光學(xué)顯微鏡受限于光的衍射效應(yīng)和光學(xué)系統(tǒng)的有限孔徑，存在分辨率極限（也稱阿貝極限），其數(shù)值約為l / 2NA（分辨率極限公式），其中l(wèi)是光波波長(zhǎng)，NA是光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑（Numerical Aperture）。, n為介質(zhì)的折射率，a為物鏡孔徑角的一半。成像時(shí)若使用波長(zhǎng)為400 nm的光，并采用空氣（折射率為1）作為物鏡和樣本之間的介質(zhì)，可計(jì)算得到分辨率極限為200 nm。因此，我們通常說(shuō)，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限約為200 nm。

此后的研究表明，光學(xué)顯微鏡的分辨率決定于光學(xué)系統(tǒng)中聚焦光斑（稱為艾里斑, Airy disc）的尺寸。另外，當(dāng)一個(gè)艾里斑的邊緣與另一個(gè)艾里斑的中心正好重合時(shí)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)物點(diǎn)剛好能被人眼或光學(xué)儀器所分辨（這個(gè)判據(jù)稱為瑞利判據(jù)，Rayleigh Criterion）。利用瑞利判據(jù)以及艾里斑的數(shù)學(xué)表達(dá)式，我們可以得到光學(xué)顯微鏡的分辨率公式：0.61λ/NA。值得指出的是，光學(xué)顯微鏡的分辨率公式跟前面提到的分辨率極限公式有所不同，而前者更廣泛的被光學(xué)成像領(lǐng)域使用。

提高光學(xué)顯微鏡分辨率的途徑為了提高光學(xué)顯微鏡的分辨率，早期的工作往往集中在如何減小艾里斑的尺寸，包括減小光的波長(zhǎng)、增大數(shù)值孔徑。對(duì)于前者，直接導(dǎo)致了各種電子顯微鏡的誕生---采用波長(zhǎng)為納米甚至亞納米級(jí)的電子束進(jìn)行成像，其分辨率可達(dá)納米量級(jí)甚至更小。對(duì)于后者，一方面可以更高折射率的成像介質(zhì)，例如，將空氣換為水（折射率為1.333），采用400 nm的光進(jìn)行成像，極限分辨率可高達(dá)150 nm。另一方面，可以利用結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的光學(xué)收集系統(tǒng)（如共軛雙物鏡）來(lái)增加光學(xué)顯微鏡的有效孔徑角，從而提高光學(xué)顯微鏡相對(duì)較差的軸向分辨率，其典型代表為4Pi顯微鏡。此外，還可以使用共焦小孔等來(lái)限制艾里斑的尺寸并消除雜散光，從而提高光學(xué)顯微鏡的橫向和縱向分辨率，其典型代表是共聚焦顯微鏡(Confocal Microscope)。

值得指出的是，這里所述的光學(xué)顯微鏡指的是遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（Far-field Optical Microscope），物鏡和樣本之間的距離遠(yuǎn)大于光的波長(zhǎng)。進(jìn)一步的研究表明，遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡存在分辨率極限的主要原因在于遠(yuǎn)場(chǎng)一般只能收集傳導(dǎo)波信號(hào)，而攜帶了高頻信息的倏逝波（Evanescent Wave），其電場(chǎng)強(qiáng)度隨傳播距離的增加而呈指數(shù)衰減。因此，若使用距樣本表面僅幾個(gè)納米的探針收集并探測(cè)近場(chǎng)光信號(hào)，可以大幅提高光學(xué)顯微鏡的分辨率，這種思路導(dǎo)致了近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡（Near-field Scanning Optical Microscope, NSOM）的誕生，其分辨率可以優(yōu)于25 nm。而基于倏逝場(chǎng)掃描成像的光學(xué)顯微鏡，通常被稱為近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（Near-field Optical Microscope）。

超分辨光學(xué)成像技術(shù)超分辨光學(xué)成像技術(shù)通常指的是基于遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡的超分辨成像技術(shù)，主要包括兩種實(shí)現(xiàn)途徑：一種是基于特殊強(qiáng)度分布照明光場(chǎng)的超分辨成像方法（如STED）。另一種是基于單分子成像和定位的方法（如PALM）。

1.受激發(fā)射損耗顯微鏡技術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy, 簡(jiǎn)稱STED）

該成像理論來(lái)源于愛(ài)因斯坦的受激輻射理論，德國(guó)科學(xué)家斯蒂芬·赫爾(Stefan W. Hell)創(chuàng)造性地利用受激輻射來(lái)抑制自發(fā)熒光輻射，最終實(shí)現(xiàn)了受激發(fā)射損耗顯微鏡技術(shù)（STED）。一個(gè)典型的STED顯微鏡需要兩束嚴(yán)格共軸的激光，其中一束為激發(fā)光，另外一束為損耗光（也稱STED光）。利用激發(fā)光使艾里斑范圍內(nèi)的熒光分子被激發(fā)，其電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。隨后，使用甜甜圈型（Doughnut，跟救生圈形狀類似）的損耗光照射樣品，使得處于激發(fā)光斑外圍的激發(fā)態(tài)分子以受激輻射的方式釋放能量回到基態(tài)，而位于激發(fā)光斑內(nèi)部區(qū)域的激發(fā)態(tài)分子則不受損耗光的影響，繼續(xù)以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。這種照明方式的組合，將熒光發(fā)射區(qū)域限制在小于艾里斑的區(qū)域內(nèi)，獲得了一個(gè)小于衍射極限的熒光發(fā)光點(diǎn)。最后，通過(guò)在二維（或三維）空間內(nèi)掃描共軸的激發(fā)光和損耗光，獲得一幅二維（或三維）超分辨圖像。1994年，斯蒂芬·赫爾等人提出了STED顯微鏡的理論。2000年，斯蒂芬·赫爾研究組通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了STED顯微鏡的超分辨成像能力。

2.光激活定位顯微鏡技術(shù)(Photoactivation Localization Microscopy, 簡(jiǎn)稱PALM)

阿貝極限指出，在遠(yuǎn)場(chǎng)無(wú)法分辨相距l(xiāng) / 2NA的兩個(gè)熒光分子所成的像，但是并沒(méi)有對(duì)單個(gè)熒光分子的中心位置確定精度進(jìn)行限制。如果在艾里斑內(nèi)僅有一個(gè)分子在發(fā)射熒光, 我們可以利用單分子定位算法并結(jié)合光學(xué)系統(tǒng)艾里斑的形狀，以超高精度（納米量級(jí)）獲得熒光分子的中心位置。倘若將這個(gè)單分子定位思想用于實(shí)現(xiàn)超分辨成像，其關(guān)鍵在于如何在一個(gè)艾里斑內(nèi)區(qū)分多個(gè)熒光分子。

為了克服一個(gè)艾里斑內(nèi)只允許一個(gè)分子發(fā)射熒光的限制,1995年美國(guó)科學(xué)家埃里克·白茲格(Eric Betzig)通過(guò)理論分析，提出可以利用光譜特性對(duì)艾里斑內(nèi)的發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光分子進(jìn)行分時(shí)探測(cè)和中心位置定位，從而實(shí)現(xiàn)熒光密集標(biāo)記樣本的超分辨成像。2006年， 埃里克·白茲格等人利用光激活綠色熒光蛋白（PA-GFP）的可控?zé)晒忾_(kāi)關(guān)特性，結(jié)合單分子定位算法，實(shí)現(xiàn)了生物樣本的超分辨成像。他們首先利用低能量的 405 nm 激光（激活光）來(lái)稀疏活化PA-GFP，再使用 561 nm激光（激發(fā)光）對(duì)活化后的PA-GFP進(jìn)行單分子熒光成像，直至活化后的PA-GFP分子被光漂白。重復(fù)激活-激發(fā)-定位-漂白過(guò)程，可以在艾里斑內(nèi)高精度找到大量PA-GFP分子的中心位置，從而重建出一幅由PA-GFP分子中心位置組成的超分辨圖像。這種技術(shù)被稱為光激活定位顯微鏡(Photoactivation Localization Microscopy, 簡(jiǎn)稱PALM)。

2006年，哈佛大學(xué)的莊小威小組提出了隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，簡(jiǎn)稱STORM），其成像原理與 PALM 類似，但是在密集標(biāo)記樣本內(nèi)實(shí)現(xiàn)熒光發(fā)射稀疏化的方案有所不同。

2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)2014年10月8日，瑞典皇家科學(xué)院宣布，將2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的埃里克·白茲格(Eric Betzig)，德國(guó)馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所的斯蒂芬·赫爾(Stefan W. Hell)，美國(guó)斯坦福大學(xué)的威廉·莫爾納(William E. Moerner)，以表彰他們?cè)诔直鏌晒獬上窦夹g(shù)領(lǐng)域取得的成績(jī)。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

黃振立 - 教授 - 華中科技大學(xué)