[科普中國]-生物活性

生物活性，在材料領(lǐng)域里主要指能在材料與生物組織界面上誘發(fā)特殊生物、化學(xué)反應(yīng)的特性，這種反應(yīng)導(dǎo)致材料和生物組織間形成化學(xué)鍵合。在生物礦化過程中，主要指生物材料與活體骨產(chǎn)生化學(xué)鍵合的能力，是衡量生物材料的一個重要指標，可通過材料表面在人體模擬體液（simulated body fluid-SBF）中形成磷灰石的能力能夠反應(yīng)材料在體內(nèi)的生物活性，此評價材料生物活性方法的應(yīng)用可以減少實驗所需動物數(shù)量，同時增加動物實驗的可持續(xù)時間 .

理論背景該概念是在 1969 年美國人 L.Hench 在研究生物玻璃時發(fā)現(xiàn)并提出，進而在生物陶瓷領(lǐng)域引入了生物活性概念，開創(chuàng)了新的研究領(lǐng)域。經(jīng)過 30 多年來的發(fā)展，生物活性的概念在生物材料領(lǐng)域已建立了牢固的基礎(chǔ)，如β-磷酸三鈣可吸收生物陶瓷等，在體內(nèi)可被降解吸收并為新生組織代替，具有誘出特殊生物反應(yīng)的作用；羥基磷灰石由于是自然骨的主要無機成分，故植入體內(nèi)不僅能傳導(dǎo)成骨，而且能與新骨形成骨鍵合，在肌肉、韌帶或皮下種植時，能與組織密合，無炎癥或刺激反應(yīng)。生物活材料具有的這些特殊的生物學(xué)性質(zhì)，有利于人體組織的修復(fù)，是生物材料研究和發(fā)展的一個重要方向。

常見材料磷酸鈣材料

磷酸鈣生物活性材料主要包括磷酸鈣骨水泥和磷酸鈣陶瓷纖維兩類。前者是一種廣泛用于骨修補和固定關(guān)節(jié)的新型材料，國內(nèi)研究抗壓強度已達60MPa以上。后者具有一定的機械強度和生物活性，可用于無機骨水泥的補強及制備有機與無機復(fù)合型植人材料。磷酸鈣纖維或晶須具有良好的生物活性和生物相容性，對人體無毒副作用，是生物陶瓷材料和有機高分子材料的理想增強材料。

羥基磷灰石

羥基磷灰石是目前研究最多的生物活性材料之一，作為最有代表性的生物活性陶瓷-羥基磷灰石[Ca10(P04)6(OH)2，簡稱HA] 。羥基磷灰石與脊椎動物骨和齒的主要無機成分相同，結(jié)構(gòu)也非常相近，與動物體組織的相容性好，無毒副作用，界面活性優(yōu)于各類醫(yī)用鈦合金、硅橡膠及植骨用碳素材料?？蓮V泛應(yīng)用于生物硬組織的修復(fù)和替換材料，如口腔種植、牙槽脊增高、耳小骨替換、脊椎骨替換等多個方面。另外，在HA生物陶瓷中耳通氣引流管、頜面骨、鼻梁、假眼球以及填充用HA顆粒和抑制癌細胞用HA微晶粉方面也有廣泛的應(yīng)用。 羥基磷灰石受到本身脆性高、抗折強度低的限制，因此在承重材料應(yīng)用方面受到了限制。目前制備多孔陶瓷和復(fù)合材料是該材料的重要發(fā)展方向，制備涂層材料也是其重要分支之一。

生物活性玻璃

生物活性玻璃是一類能對機體組織進行修復(fù)、替代與再生、具有能使組織和材料之間形成鍵合作用的材料。生物活性玻璃（bioactiveglass，BAG）在1969年由Hench發(fā)現(xiàn)，由SiO2，Na2O，CaO和P2O5等基本成分組成的硅酸鹽玻璃。生物活性玻璃的降解產(chǎn)物能夠促進生長因子的生成、促進細胞的繁衍、增強成骨細胞的基因表達和骨組織的生長。是迄今為止唯一既能夠與骨組織成鍵結(jié)合，同時又能與軟組織相連接的人工生物材料。

活性檢測成骨活性材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能夠反應(yīng)材料在體內(nèi)的生物活性，具體檢測方法如下：

1.SBF 配置

由于SBF 溶液對于磷灰石過飽和，所以配備方法不恰當(dāng)會導(dǎo)致溶液中磷灰石沉淀產(chǎn)生。整個配備過程需要確保溶液無色、透明，容器表面無沉淀出現(xiàn)，如果過程中產(chǎn)生沉淀，倒去溶液，洗凈儀器重新配制。準備一個 1000ml 的塑料燒杯。首先于塑料燒杯中裝好 700ml 離子交換蒸餾水、一個適當(dāng)大小磁子，杯口密封以蒸發(fā)皿或塑料薄膜。攪拌并調(diào)節(jié)水溫至 36.5±1.5C。

按表1所列順序在 36.5C 恒溫下逐個溶解第一到第八個化合物，溶解過程

表1 配置1000 ml SBF 溶液時試劑添加順序、添加量

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2.磷灰石形成能力測試

對于密質(zhì)薄片材料，測出樣品尺寸并計算樣品表面積精確到 2mm 應(yīng)用如下公式計算出 SBF 用量：

Vs=Sa/10,

Vs（ml）是 SBF 的體積量，Sa（mm）表示樣品的表面積。

對于多孔材料，SBF 的用量應(yīng)大于上式計算量準備好塑料瓶或燒杯，裝入計算出的 SBF 體積量加熱到 36.5C， 然后按示意圖往里放置樣品。 筆記：樣品在容器中放置有兩種情況，如圖 1(a)，1(b)。少數(shù)情況下，SBF 溶液會生成同 質(zhì)磷灰石沉積于樣品表面。所以如果樣品放置是圖 A1(b)種情況，表征實驗應(yīng)該檢測樣品的 下表面。 四個星期內(nèi)，分別取出恒溫浸透不同時長的各組樣品，純水輕盈洗凈。然后將樣品放入干燥 器中常溫干燥。

圖1 SBF中樣品浸泡示意圖

細胞活性1.四唑鹽（MTT）比色法：

檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色法試驗（MTT）。此法的原理是：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物，并沉積在細胞中，而細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的藍紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測，以在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應(yīng)活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比。

●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基配成1x10^9個/L的但細胞懸液，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul。

●將培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)3-5天。

●培養(yǎng)3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3-6h，終止培養(yǎng)，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養(yǎng)數(shù)小時，將細胞內(nèi)與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。

●用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔吸光度（OD），選波長490nm。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

用此法測細胞活力，為保證結(jié)果的準確性，最好在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，再確定每孔細胞接種數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止時不會過滿。另外，實驗時設(shè)空白對照，比色時，以空白孔調(diào)零。

3.2.2 CCK-8 法

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

● 制備細胞懸液：細胞計數(shù)

● 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復(fù)。

● 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。

●培養(yǎng)1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

●測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

本詞條內(nèi)容貢獻者為:

成艷 - 副教授 - 北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院