[科普中國]-神奈川試驗

神奈川試驗的定義

神奈川試驗即食品中副溶血性弧菌檢驗方法，屬于食品中微生物的檢驗，標(biāo)準(zhǔn)是GB/T4789.7-2008-副溶血性弧菌檢驗。神奈川試驗是在我妻氏瓊脂上測試是否存在特定溶血素。神奈川實驗陽性結(jié)果與副溶血性弧菌分離株的致病性顯著相關(guān)。用接種環(huán)將測試菌株的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂18h培養(yǎng)物點種表面干燥的我妻氏血瓊脂平板。每個平板可以環(huán)狀點種幾個菌。35士1攝氏度培養(yǎng)不超過24h，并立即觀察。陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的β溶血1。

神奈川試驗的內(nèi)容副溶血性弧菌有845個血清型，主要通過十三種耐熱的菌體抗原(即O抗原)鑒定，而七種不耐熱的包膜抗原(即K抗原)可以用來輔助鑒定。其致病力可用神奈川(kanagawa)試驗來區(qū)分。該菌能使人或家兔的紅細(xì)胞發(fā)生溶血，在瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)β溶血帶，稱為"神奈川試驗"陽性。神奈川試驗陽性菌的感染能力強，多數(shù)毒性菌株為神奈川試驗陽性(K+)，多數(shù)非毒性菌株為神奈川試驗陰性(Kˉ)。引起食物中毒的副溶血性弧菌90%神奈川試驗陽性，通常在12h內(nèi)出現(xiàn)癥狀。K+菌株能產(chǎn)生一種耐熱型直接溶血素，Kˉ菌株能產(chǎn)生一種熱敏型溶血素，而有些菌株能產(chǎn)生這兩種溶血素。

神奈川試驗的培養(yǎng)基和試劑硫代硫酸鹽檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂
3%氯化鈉胰蛋白胨大豆〔TSA）瓊脂
3%氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂
嗜鹽性試驗培養(yǎng)基
3%氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基
3%氯化鈉賴氨酸脫狡酶試驗培養(yǎng)基
3%氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基
我妻氏血瓊脂
氧化酶試劑
革蘭氏染色液
ONPG試劑
3%氯化鈉溶液
Voges-Proskauer（V-P）試劑
弧菌顯色培養(yǎng)基
API20E生化鑒定試劑盒或VITEKNFC生化鑒定卡

神奈川試驗的設(shè)備和材料如下恒溫培養(yǎng)箱：36士1攝氏度；

冰箱2-5攝氏度；
均質(zhì)器或無菌乳缽；
天平感量0.1g；
無菌試管：18mm*180mm,15mm*100mm；
無菌吸管：1mL(具0.01ml刻度）,10mL（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭；
無菌錐形瓶：500mL，250mL；
無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm；
全自動微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK）；

神奈川試驗的操作步驟1.樣品制備
1.1冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15min或在2-5攝氏度不超過18小時解凍，若不能及時檢驗應(yīng)放于--15攝氏度左右保存；非冷凍而易腐蝕的樣品應(yīng)盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應(yīng)置2-5攝氏度冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗。
1.2魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部內(nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個動物，或者動物的中心部分，包括腸和鰓，如為帶殼貝類或甲殼類則應(yīng)先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，按照上述要求取相應(yīng)部分。
1.3以無菌操作取檢樣25g（ml），加人3%氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，制備成1：10的均勻稀釋液。如無均質(zhì)器，則將樣品放人無菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內(nèi)，加225ml3%氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。
2增菌
2.1定性檢測
將上述1:10稀釋液于36℃士1℃培養(yǎng)8h～18h。
2.2定量檢測
2.2.1用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含右9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1：100的稀釋液
2.2.2另取1mL滅菌吸管，按上述操作依次制備10倍遞增稀釋液每遞增稀釋一次，換用一支lmL滅菌吸管.
2.2.3根據(jù)對檢樣污染情況的估計,選擇三個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度接種三支含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃士1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8h--18h
3分離
3.1在所有顯示生長的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，于TCBS平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板，于36℃士1℃培養(yǎng)18h-24h。
5.3.2典型的副溶血性弧菌在TCBSL呈圓形、半透明、表而光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm-3mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應(yīng)盡決（不超過1h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上呈圓形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm-3mm。
4純培養(yǎng)
挑取三個或以上可疑菌落，劃線3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃土l℃培養(yǎng)18h-24h。
5初步鑒定
5.1氧化酶試驗：挑選純培養(yǎng)的單個菌落進(jìn)行氧化酶試驗，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。
5.2涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色．鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。
5.3挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，接種3%氯化鈉三糖鐵涼脂斜面并穿刺底層，35℃士1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。
5.4嗜鹽性試驗：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落．分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃士1℃培養(yǎng)24h觀察液體混濁清況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在7%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛2。
6確定鑒定
6.1生化試驗：取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇、賴氨酸、MR-VP培養(yǎng)基，36℃士1℃培養(yǎng)24h--18h后觀察結(jié)果。隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗。
5.6.2API20E生化鑒定試劑盒或VITEK：刮取3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液．使用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK鑒定。
7報告
當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表1要求時，報告25g(ml)樣品中檢出副溶血性弧菌。如果進(jìn)行定量檢測，根據(jù)證實為副溶血性弧菌陽性的試管管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報告每克(毫升）副溶血性弧菌的MPN值。