[科普中國(guó)]-融合子

定義

融合子是指兩種遺傳性不同的植物或微生物細(xì)胞去掉細(xì)胞壁之后，經(jīng)過一定的手段將兩者融合成的一個(gè)新的細(xì)胞。

細(xì)胞工程是指在細(xì)胞水平上對(duì)生物進(jìn)行改造的一項(xiàng)綜合性技術(shù)。對(duì)微生物而言，由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，為單細(xì)胞、簡(jiǎn)單多細(xì)胞、甚至無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此從細(xì)胞層面上對(duì)其的改造已經(jīng)歷了很長(zhǎng)時(shí)間。如誘變育種，從某種意義上說就是在細(xì)胞水平上對(duì)物種進(jìn)行改造的過程，但就現(xiàn)代微生物細(xì)胞工程來說，主要是指微生物的原生質(zhì)體融合。

所謂原生質(zhì)體融合是指用人工方法將遺傳性狀不同的兩菌株的原生質(zhì)體融合在一起，使融合子攜帶雙親優(yōu)良性狀的一種新技術(shù)。它是在有性雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。我們知道，釀酒酵母的a型與a型菌株在自然條件下能發(fā)生融合。但不同種，不同屬，甚至同種的同一結(jié)合型之間的酵母菌株卻不能，如果將酵母菌的細(xì)胞壁去除，用物理、化學(xué)或生物的手段使兩者結(jié)合在一起，就有可能融合成一個(gè)新細(xì)胞，這樣就為微生物的育種開辟了一條新途徑。1

融合方法目前原生質(zhì)體融合的方法主要有化學(xué)融合法、電融合法與激光誘導(dǎo)融合法2。

化學(xué)融合法目前最常用的是PEG(聚乙二醇)助融法。將兩親本的原生質(zhì)體等量混合在高滲液中，加入PEG助融，輕輕振蕩促使原生質(zhì)體融合。PEG作為促融劑，因其單體聚合程度不同而分子量差異很大，所以不同種的原生質(zhì)體采用不同分子量的PEG。細(xì)菌一般采用30%～50%(w/v)的PEG，同時(shí)加入Ca2+與DMSO進(jìn)一步促融，時(shí)間約為60s。真菌則采用25%～30%的高分子量PEG，pH9．0為佳，也需要加入Ca2+提高融合。而曲霉菌則采用20%PEG6000，母液為1～50mmol/L甘氨酸，pH7．5，處理時(shí)間為10～30min，融合頻率可達(dá)0．1%。Kavanagh在對(duì)釀酒酵母或白色念珠菌的融合實(shí)驗(yàn)中，采用PEG 3350，濃度分別為40%和60%，pH7．0，結(jié)果表明，對(duì)于釀酒酵母用40%PEG加lmmol/L乙酸鈣系統(tǒng)融合頻率最高，而對(duì)于白色念珠菌，PEG濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響，但在pH4．7的條件下，融合效果明顯高于pH 7．0。3

電融合法電融合法是利用直流或交流電場(chǎng)，使兩親本的原生質(zhì)體進(jìn)行融合。原生質(zhì)體在電場(chǎng)中極化成偶極子，沿電力線排列成串珠狀，在兩極問的高壓由脈沖擊下?lián)舸┚o密接觸的細(xì)胞質(zhì)膜，在細(xì)胞膨壓的作用下完成融合。此法具有融合頻率高，對(duì)細(xì)胞無(wú)化學(xué)毒害，還具有空間定向和時(shí)間同步可調(diào)控性，在顯微鏡下進(jìn)行電融合，還可觀察到融合的過程，此法的一個(gè)缺點(diǎn)是電場(chǎng)大小不易控制，如果電場(chǎng)大容易使原生質(zhì)體大量死亡。4

激光誘導(dǎo)融合法利用激光束對(duì)相鄰的兩個(gè)原生質(zhì)體接觸區(qū)進(jìn)行穿孔，使原生質(zhì)體進(jìn)行融合。原理與電融合法相同。在操作時(shí)也要注意激光束的強(qiáng)度。4

篩選方法假設(shè)用于原生質(zhì)體融合的兩親本的基因型分別為A型和B型，那么經(jīng)過融合后，整個(gè)群體中含有5種類型，即A型、AA型、AB型、BB型、B型。其中只有AB型才有可能形成真正的雜合細(xì)胞，而其余4種均被淘汰。但AB型融合子在整個(gè)群體中的比例是很小的。所以選用適當(dāng)?shù)姆椒◤娜诤先后w中選擇目的融合子顯得非常重要。1

利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型作為篩選標(biāo)記是最傳統(tǒng)的有效而直接的辦法，即二親本是不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，融合后于高滲基本培養(yǎng)基上再生，融合子由于遺傳物質(zhì)的互補(bǔ)回復(fù)為野生型從而可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而親本則不能生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑一般為17%的蔗糖。對(duì)于K氏釀酒酵母，在再生培養(yǎng)基中加入酵母細(xì)胞壁合成前體物質(zhì)或者牛血清白蛋白及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以明顯提高融合子的再生能力。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以分為兩種，一種為直接法，即將融合液涂布在基本培養(yǎng)基上，直接從中選出融合子；另一種為間接法，即讓親本與融合子都可以得到再生，長(zhǎng)出菌落后接種到不同的選擇培養(yǎng)基上，從選擇培養(yǎng)基上檢出融合子。應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇存在的一個(gè)缺點(diǎn)就是親本要有不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷，而獲得不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷比較麻煩，涉及到用物理的或者化學(xué)的方法進(jìn)行誘變。誘變的結(jié)果可能造成一些優(yōu)良性狀丟失。3

利用抗藥性篩選微生物的抗藥性是其菌種的特性，是由遺傳物質(zhì)決定的。不同微生物對(duì)某一種藥物的抗性存在差異，利用這種差異或者與菌種的其他特性結(jié)合起來就可以對(duì)融合子進(jìn)行篩選。2

利用二親本不同的優(yōu)良性狀篩選如果二親本具有不同的優(yōu)良性狀，比如能代謝不同的底物，它們的融合子就同時(shí)具有親本的優(yōu)良性狀。例如在篩選高溫乙醇發(fā)酵的酵母的實(shí)驗(yàn)中就是利用二親本的不同優(yōu)良性狀。釀酒酵母A001產(chǎn)酒率為10．2%，能發(fā)酵麥芽糖。但是在45℃的條件下不能生長(zhǎng)；克魯維酵母Y304為呼吸缺陷型，產(chǎn)酒率為3．6%，不能發(fā)酵麥芽糖，但是能在45℃的條件下生長(zhǎng)。將這兩種親本酵母融合后，融合子既能發(fā)酵麥芽糖又能在45℃的條件下生長(zhǎng)。這樣就可以在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中，在45℃的培養(yǎng)箱中篩選融合子。

在篩選能利用淀粉的大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中，親本大腸桿菌是不能利用淀粉的，其為革蘭陰性；枯草桿菌是可以利用淀粉的，其為革蘭陽(yáng)性。將二親本的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，然后在含有淀粉的培養(yǎng)基上進(jìn)行再生。隨機(jī)挑取在再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，于油鏡下觀察，選取沒有芽孢的細(xì)菌制成菌懸液，在淀粉培養(yǎng)基上于28。C培養(yǎng)24h，加碘液，出現(xiàn)透明圈，挑取出現(xiàn)透明圈的細(xì)菌在油鏡下觀察確認(rèn)沒有芽孢的存在。重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步確認(rèn)。

在構(gòu)建具有殺傷能力并可以利用淀粉的酵母實(shí)驗(yàn)中，利用融合子既具有殺傷性能又可以在含有以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的這一性質(zhì)，就可將融合子與親本分開。2

利用供體滅活法篩選親本之一的原生質(zhì)體經(jīng)過物理方法(紫外線照射、短時(shí)加熱等)處理失活而作為遺傳物質(zhì)的供體，然后與另一親本的原生質(zhì)體進(jìn)行融合。利用該法可以省去一株親本的原生質(zhì)體制備步驟，但是融合率比較低。嗜殺啤酒酵母FP5—24的選育就是利用該法篩選的。首先用紫外線滅活含有嗜殺質(zhì)粒的供體酵母的原生質(zhì)體(確保滅活后不能再生)，然后用該滅活的原生質(zhì)體與啤酒酵母CDW-4的原生質(zhì)體融合。利用受體酵母對(duì)嗜殺毒素的敏感性選出融合子FP5—24。該融合子的釀造性能與受體菌保持相同但是具有嗜殺活性。2

利用雙親原生質(zhì)體滅活法篩選將二親本的原生質(zhì)體用不同的理化手段進(jìn)行處理，相應(yīng)地使某一部位的生理結(jié)構(gòu)被損傷而失去活性，但不是將原生質(zhì)體徹底殺死。滅活后的原生質(zhì)體不能再生，而由損傷部位不同的原生質(zhì)體相結(jié)合形成的融合子，因?yàn)閾p傷部位可以互補(bǔ)則可以再生。由于雙親原生質(zhì)體滅活融合減少了尋找穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記的繁瑣的工作以及由此可能帶來的親本優(yōu)良性狀的丟失，而且使融合子的篩選變得直觀簡(jiǎn)便，大大提高了篩選效率。但是與上述篩選方法相比，它的融合效率是較低的。周東坡等人通過將酵母親本原生質(zhì)體分別在52℃水浴中處理30min以及用紫外線照射20min，然后將處理后的原生質(zhì)體融合，直接篩選融合子，得到一株啤酒酵母的新菌株，具有絮凝性比親本好、雙乙酰含量比雙親低、生長(zhǎng)比親本快的優(yōu)良性狀。2

利用熒光染色法篩選利用不同的熒光色素來標(biāo)記親本的原生質(zhì)體，使其在特定波長(zhǎng)光的激發(fā)下發(fā)出不同的熒光，融合后在熒光顯微鏡下挑選具有雙親兩種熒光的融合子。利用該方法要考慮熒光色素對(duì)原生質(zhì)體的活性影響以及兩種色素的分辨度，該方法與上述方法相比在操作上比較麻煩，所以運(yùn)用該方法來篩選比較少。2