[科普中國(guó)]-愈傷

基本信息

愈合組織包括受傷細(xì)胞表面栓質(zhì)化或木質(zhì)化，以及皮下的細(xì)胞分裂形成傷周皮組織。愈傷的形成可減少水分蒸騰、氧化變質(zhì)，還可阻止病菌侵入，從而恢復(fù)被破壞的表面保護(hù)結(jié)構(gòu)。農(nóng)產(chǎn)品在采收后的各項(xiàng)處理中會(huì)受到多種傷害，這時(shí)受傷部分及附近細(xì)胞處于非正常狀態(tài)，而引起種種異常反應(yīng)，愈傷組織的形成可使產(chǎn)品恢復(fù)正常的生理功能，對(duì)儲(chǔ)藏很有好處。完整的愈傷應(yīng)該具備栓質(zhì)化和形成傷周皮兩個(gè)過程，兩者的完整性和形成速度受環(huán)境條件的影響很大，在儲(chǔ)藏前應(yīng)該創(chuàng)造最適宜的愈傷條件，以促使盡快形成完整的愈合組織?；ɑ墚a(chǎn)品表面受傷部分，在適宜環(huán)境條件下，自然形成愈合組織的生物學(xué)過程。 指植株表面受傷部分在適宜環(huán)境條件下自然形成愈合組織的生物學(xué)過程。

愈合組織包括受傷細(xì)胞表面栓質(zhì)化或木質(zhì)化，以及皮下的細(xì)胞分裂形成傷周皮組織。愈傷的形成可減少水分蒸騰、氧化變質(zhì)，還可阻止病菌侵入，從而恢復(fù)被破壞的表面保護(hù)結(jié)構(gòu)。農(nóng)產(chǎn)品在采收后的各項(xiàng)處理中會(huì)受到多種傷害，這時(shí)受傷部分及附近細(xì)胞處于非正常狀態(tài)，而引起種種異常反應(yīng)，愈傷組織的形成可使產(chǎn)品恢復(fù)正常的生理功能，對(duì)儲(chǔ)藏很有好處。完整的愈傷應(yīng)該具備栓質(zhì)化和形成傷周皮兩個(gè)過程，兩者的完整性和形成速度受環(huán)境條件的影響很大，在儲(chǔ)藏前應(yīng)該創(chuàng)造最適宜的愈傷條件，以促使盡快形成完整的愈合組織。

愈傷組織類型及特征
1.結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽
2.結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立
3胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。
胚性發(fā)育(embryonal development) 幼胚接種到培養(yǎng)基上以后,仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育,最后形成成熟胚(有時(shí)甚至可能類似種子),然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株,這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個(gè)幼胚將來就是一個(gè)植株。
愈傷組織(callus) 在許多情況下,幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖,形成愈傷組織.一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織,這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。
各種植物細(xì)胞在植物體內(nèi)都處于分化狀態(tài)。要使植物細(xì)胞從分化狀態(tài)過渡到有繁殖能力的分生狀態(tài)，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)必須發(fā)生深刻的變化，否則無法完成這個(gè)過渡。這種在植物體上已分化的細(xì)胞和組織，在培養(yǎng)條件下逐漸恢復(fù)到分生狀態(tài)的過程，叫作脫分化。已經(jīng)脫分化的細(xì)胞在一定條件下，又可經(jīng)過愈傷組織或胚狀體，再分化出根和芽，形成完整植株，這一過程叫作再分化。組織培養(yǎng)的過程，就是植物細(xì)胞的脫分化和再分化的過程，而這一過程又是在細(xì)胞全能性的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，是細(xì)胞全能性發(fā)揮作用的結(jié)果?；ɑ墚a(chǎn)品表面受傷部分，在適宜環(huán)境條件下，自然形成愈合組織的生物學(xué)過程1。

玉米愈傷組織的形成外植體處理首先選取飽滿、干凈、無病蟲害侵染的成熟種子在超凈工作臺(tái)上用 ddH2O 清洗，隨后以 75%的酒精浸泡 5min。再用 0.1%的 HgCl2浸泡 10min，然后用 ddH2O 清洗 3～5 次，最后以 ddH2O 在 26℃下浸泡 48 小時(shí)。

全胚的切取將浸泡好的玉米種子放置于高壓滅菌的大培養(yǎng)皿中，鑷子夾住種子，用無菌解剖刀削離出全胚，并用無菌鑷將其接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上盾片朝下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

胚根、胚軸的切取在超凈工作臺(tái)上將浸泡好的玉米種子沿胚軸縱切為二，用無菌解剖刀從胚中挑出培根、胚軸，胚芽用無菌鑷將其接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)。

外植體培養(yǎng)將已接于不同培養(yǎng)基的外植體置于溫度為 25±1℃的人工氣候培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，三周左右統(tǒng)計(jì)愈傷組織、出芽數(shù)及出根情況。

愈傷組織繼代及分化培養(yǎng)將初代愈傷組織每隔 10d 轉(zhuǎn)移到新鮮的繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng) 2～3 次后，挑選出胚性愈傷組織并及時(shí)轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基并在溫度為 28±1℃,弱光照（白色熒光燈提供）人工氣候箱進(jìn)行分化培養(yǎng)2。

番茄愈傷組織的形成

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無菌番茄苗的播種與獲取超凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外殺菌20-30 min后，在酒精燈上對(duì)將要使用的鑷子及鑷子架進(jìn)行高溫灼燒殺菌，之后取300顆Micro-Tom番茄種子裝入已滅菌的50 mL離心管，用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒5 min，消毒期間需不停的震蕩。倒掉乙醇，用無菌水清洗1min后，再用10%的次氯酸鈉（現(xiàn)配現(xiàn)用）消毒8 min。倒掉次氯酸鈉，用無菌水清洗4-6次，每次不少于1 min。用之前灼燒過的鑷子（已冷卻到常溫），將種子均勻播種到含有MS基本培養(yǎng)基（T0）的培養(yǎng)瓶中，種子間距離以1 cm為佳（每瓶大概播種30粒）。將組培瓶置于27℃，暗培養(yǎng)4-5天左右，待長(zhǎng)出1-2 cm的白色芽時(shí)，將其移到光下（光照強(qiáng)度2000LX，16 h/d）25℃培養(yǎng)3-4天左右，待莖長(zhǎng)到5-6 cm，子葉完全伸展，真葉似見未見時(shí)可用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

外植體預(yù)培養(yǎng)超凈工作臺(tái)紫外殺菌后，將滅過菌的濾紙放入含有預(yù)（共）培養(yǎng)培養(yǎng)基（T1）的平皿中。取滅過菌的玻璃平皿，倒入無菌水，將無菌番茄苗（子葉完全伸展，真葉似見未見）從組培瓶中取出，靠在裝有無菌水的平皿上。將無菌番茄苗的根和子葉葉尖剪除，子葉剪成1cm左右的小方形，去除生長(zhǎng)點(diǎn)，分散的擺放在濾紙上。將培養(yǎng)皿用封口膜封住，放在暗箱內(nèi)，25℃預(yù)培養(yǎng)2天。

農(nóng)桿菌活化用接種針沾取少許保藏于-80℃冰箱的真核表達(dá)載體農(nóng)桿菌液，在含利福平（50 mg/mL）、壯觀霉素（100 mg/L）的LB固體培養(yǎng)基上劃線接種，將平板倒置在28C的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的農(nóng)桿菌單菌落接種2-5 mL含利福平（50 mg/mL）、壯觀霉素（100 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm小搖過夜。按1:10的比例轉(zhuǎn)接至20 mL含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5-0.65000 rpm常溫離心10 min，收集菌體后用無菌水重懸，使菌液OD600在0.1-0.2之間。

農(nóng)桿菌侵染外植體超凈工作臺(tái)紫外殺菌后，將暗處預(yù)培養(yǎng)兩天的外植體從濾紙上取下，收集到已滅菌的玻璃皿內(nèi)。將無菌水重懸的OD600在0.1-0.2的菌液，倒入到含有外植體的皿內(nèi)，侵染5 min，期間保持平皿的勻速震蕩。倒掉菌液后，用無菌水清洗4-6次，每次不少于1min。將外植體重新放回到預(yù)（共）培養(yǎng)培養(yǎng)基（T1）的濾紙上。將培養(yǎng)皿用封口膜封住，放在暗箱內(nèi)，25℃共培養(yǎng)2天。

外植體的抗性篩選超凈工作臺(tái)紫外殺菌后，將暗處共培養(yǎng)兩天的外植體，從預(yù)（共）培養(yǎng)培養(yǎng)基（T1）的濾紙上取下，移到分化選擇培養(yǎng)基（T21）上。將培養(yǎng)皿用封口膜封住，將其移到光下（光照強(qiáng)度2000LX，16 h/d）25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，應(yīng)及時(shí)將外植體跟換到新的分化選擇培養(yǎng)基（T21）上，避免營(yíng)養(yǎng)缺乏，防止褐變現(xiàn)象。

外植體的伸長(zhǎng)培養(yǎng)分化選擇培養(yǎng)基（T21）上的外植體由愈傷組織分化出芽時(shí)，將其從分化選擇培養(yǎng)基（T21）上移到芽伸長(zhǎng)選擇培養(yǎng)基（T22）的組培瓶?jī)?nèi)，促進(jìn)分化芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和抗生素效價(jià)的降低，芽伸長(zhǎng)選擇培養(yǎng)基（T22）需要每?jī)芍芨鼡Q一次。

外植體的生根培養(yǎng)當(dāng)芽伸長(zhǎng)選擇培養(yǎng)基（T22）上的芽生長(zhǎng)到3-4 cm時(shí)，需要將芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（Tr）中。在轉(zhuǎn)移時(shí)，芽必須分化出生長(zhǎng)點(diǎn)，且將未分化出生長(zhǎng)點(diǎn)的不定芽剪除，以減少葉片的蒸騰拉力，促進(jìn)番茄芽根的分化與生長(zhǎng)。一般情況下，3-4周可見幼根的出現(xiàn)，幼根生長(zhǎng)2-3周左右即可。

轉(zhuǎn)基因番茄苗的煉苗當(dāng)轉(zhuǎn)基因番茄苗的根系發(fā)育良好時(shí)，番茄植株長(zhǎng)到10-15 cm左右時(shí)，即可將組培瓶的蓋子逐漸擰松，過3天后將其完全打開，并加入0.5-1 cm蒸餾水在光下（光照強(qiáng)度2000LX，16h/d）25C煉苗2 d。

轉(zhuǎn)基因番茄苗的移栽移栽前，要先將培養(yǎng)土（蛭石：營(yíng)養(yǎng)土=1:3）分裝到花盆中，從花盆底部加水，使培養(yǎng)土完全濕透。煉苗后，將苗取出，洗去根部培養(yǎng)基殘?jiān)?，將幼苗移栽至澆足水的培養(yǎng)土花盆中，其上罩上塑料薄膜，移至溫室培養(yǎng)。期間要不斷往托盤中加水，減少蒸騰拉力3。

蕎麥愈傷組織的形成蕎麥愈傷組織的誘導(dǎo)蕎麥種子發(fā)芽后 10 天左右,選取健壯的蕎麥無菌苗,以胚軸為外植體,切成約 0.5cm的小段,每瓶均勻接種 4 小段,在 MS 固體培養(yǎng)基(附加 2.0mg/L 2,4-D 和 3%蔗糖)上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),培養(yǎng)條件:溫度 25±2℃,每日提供 2200lx 光照16h。

蕎麥愈傷組織的繼代培養(yǎng)與生長(zhǎng)愈傷組織誘導(dǎo) 2 周后,選取鮮綠色、疏松顆粒狀的長(zhǎng)勢(shì)一致的愈傷組織接種到不同試驗(yàn)處理組的三角瓶中。每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)接種愈傷組織 1.0±0.1g(鮮重),平均分 4 塊均勻接種,每個(gè)處理 3 次重復(fù)(即接種 3 瓶),每 15 天繼代一次4。