[科普中國]-熒光假單胞菌

臨床意義

可從傷口、痰、胸水、尿和血液中分離出來，也可從血庫存在中分離出?？稍诒鋬Υ娴难杭把褐破分蟹敝?，而且自溶后釋放內(nèi)毒素。其內(nèi)毒素的磷脂部分，可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克。

生物學(xué)作用以原核生物16S保守序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法，從熒光假單胞菌基因組中擴(kuò)取其16S保守序列，連接到T-載體，以設(shè)計(jì)好的限制性內(nèi)切酶，分別切割表達(dá)載體（pET32a、pMAL-c2、pGEX-6p-1 ）和目的基因，然后將目的基因與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌（BL21、Origami），并以酶切方法驗(yàn)證連接的正確性；誘導(dǎo)表達(dá)后即可得到LPL（脂蛋白脂肪酶）

熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)

分類學(xué)上屬于細(xì)菌域、變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬。細(xì)胞為直的桿菌，大小為0.7-0.8X2.3-2.8 微米，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陰性。有數(shù)根極生鞭毛，運(yùn)動。需氧,進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝,以氧為最終電子受體。能以硝酸鹽為替代的電子受體進(jìn)行厭氧呼吸。化能營養(yǎng)異養(yǎng)，不需要有機(jī)生長因子。氧化酶陽性，接觸酶陽性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果聚糖，明膠液化。生長溫度范圍 4-37℃，最適生長溫度是25-30℃。 DNA中G+C 含量是60-61%。廣泛分布于自然界，如土壤、水、植物及動物活動環(huán)境中。該菌生化能力活躍，可降解許多人工合成化合物，常被用于環(huán)境保護(hù)。

還是一種重要的植物根際促生細(xì)菌,是已知植物根際有益微生物中種群數(shù)量較多的細(xì)菌種類之一。該菌營養(yǎng)需要相對簡單,能夠利用根系分泌物中大部分營養(yǎng)迅速在植物根圍定殖。其中一些菌株具有促進(jìn)植物生長和防治病害的作用,因而可能用于植物病害的生物防治。

相關(guān)污染事例【北京工商局稱“發(fā)光豬肉”為細(xì)菌引起】北京市工商局13日回應(yīng)稱，北京市食品安全監(jiān)控中心對送檢“發(fā)光豬肉”樣本進(jìn)行了檢測，送檢樣本均未檢出熒光增白物質(zhì)，但檢出了熒光假單胞菌。專家表示，這種細(xì)菌并不可怕，對正常人群不具有致病性，只要豬肉本身沒有腐敗變質(zhì)，煮熟即可殺滅該細(xì)菌。（新京報(bào)）

熒光假單胞菌的檢測方法目前我國對乳制品中嗜冷菌數(shù)量的檢測采用國家標(biāo)準(zhǔn)NYT 1331-2007中平板計(jì)數(shù)的方法，對熒光假單胞菌沒有專門的國標(biāo)，但是國內(nèi)外對熒光假單胞菌檢測技術(shù)有豐富的研究。

平板計(jì)數(shù)法國際乳品聯(lián)合會（IDF）采用 IDF Standard 101A 和 IDF Standard 132A檢測標(biāo)準(zhǔn)，前者采用 6.5℃培養(yǎng)10天后平板計(jì)數(shù)，后者 21℃培養(yǎng) 25h后計(jì)數(shù)，132A培養(yǎng)時間短穩(wěn)定性好，菌數(shù)較為準(zhǔn)確。平板計(jì)數(shù)法將原料乳稀釋后，采用涂布法，傾注法，3M細(xì)菌總數(shù)試紙等方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，傾注法由于溫度較高導(dǎo)致精確度較低，3M 試紙精確度和效率較高。平板計(jì)數(shù)法是傳統(tǒng)的檢測方法，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，但耗時太長，25h遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)快速檢測的要求。

直接熒光過濾法直接熒光法DEFT（Direct Epifluorescent Filter Technique）是利用電離輻射對食品樣品菌落計(jì)數(shù)的方法，操作簡便，具有高通量性。將樣品通過過濾器后，吖啶橙染色，在紫外顯微鏡下活細(xì)胞能觀察到橘黃色，而死細(xì)胞染成綠色，可以統(tǒng)計(jì)出樣品中所有菌落的總數(shù)。原料乳用濾膜過濾后染色，計(jì)數(shù)得熒光假單胞菌相關(guān)性系數(shù)為0.91，且在25min內(nèi)完成檢測。相對于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法，DEFT 大大縮短檢測時間，利用其原理，可以實(shí)現(xiàn)對多種食品中菌落數(shù)的快速檢測。但是 DEFT 的靈敏度不高，只能用于檢測一定范圍內(nèi)菌落數(shù)，當(dāng)食品中菌數(shù)含量較少時沒有良好的線性關(guān)系，且實(shí)驗(yàn)儀器比較昂貴，在工業(yè)生產(chǎn)中不能很好的適用。

流式細(xì)胞法流式細(xì)胞法FCM（Flow Cytometry Method）可以檢測菌液中標(biāo)記熒光信號的單細(xì)胞，對菌株實(shí)現(xiàn)逐一定量分析。流式細(xì)胞法檢出的菌數(shù)是平板計(jì)數(shù)法的 3.8 倍，因?yàn)槟芙y(tǒng)計(jì)到總體菌落數(shù)量。利用這個方法檢測牛奶中假單胞菌，能在4 h內(nèi)完成檢測，且在菌落數(shù)含量較少時靈敏度有很大的提高。此方法可以快速準(zhǔn)確的檢測原料乳中熒光假單胞菌含量，但流式細(xì)胞法操作過程較為復(fù)雜，且容易被多種因素影響檢測到的結(jié)果。

PCR 法針對16S rRNA 保守序列設(shè)計(jì)引物，通過 PCR 擴(kuò)增，可以將牛奶中嗜冷菌擴(kuò)增出147bp的 DNA片段，標(biāo)記后用 ELISA 檢測，得到熒光假單胞菌AH-70 的OD450和菌濃度的方程，分析得此方法和平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.94，可以檢測菌濃度范圍是103-107CFU/mL。PCR 檢測具有很高的靈敏度，特異性較強(qiáng)，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)原料奶中埃希腸桿菌的濃度達(dá)到 10CFU/mL 時能被檢測出來。PCR 檢測菌落數(shù)結(jié)果同樣會受到死菌株數(shù)的影響，而且在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中對食品提取可以PCR擴(kuò)增的DNA難度很大，容易被食品體系中因素影響精確度。

氨肽酶法氨肽酶法通過革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的氨肽酶與特定的化合物反應(yīng)，檢測氨肽酶的活性。呂元等人用氨肽酶法，對杭州地區(qū)原料奶中熒光假單胞菌，阪崎腸桿菌和魯氏不動桿菌 3 種優(yōu)勢嗜冷菌進(jìn)行快速檢測。結(jié)果得出 3 種菌的濃度和氨肽酶活性存在顯著的相關(guān)性，且與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果沒有顯著差異，可以在很大程度上縮短檢測的時間。在檢測冷藏肉類中嗜冷菌報(bào)道，氨肽酶法的檢測范圍是104-108CFU/mL，檢測時間為2.5 h，與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的相關(guān)性為0.88。顯然氨肽酶法能達(dá)到快速檢測的效果，氨肽酶法適用于定性檢測，可以根據(jù)反應(yīng)顏色用肉眼觀察，但檢測靈敏度較其他方法差，最大的問題是原料樣品中的革蘭氏陽性菌無法被檢出，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

ELISA 法ELISA 法通過抗體特異性反應(yīng)檢測菌落數(shù)，具有高靈敏性，也易于同其他方法結(jié)合。PicardC 等人通過測定酪蛋白糖多肽計(jì)算原料乳中嗜冷菌含量。利用單克隆抗體，檢測出成品奶樣中嗜冷菌，與平板計(jì)數(shù)法相關(guān)性達(dá) 0.96。從脫脂奶粉中檢測6種沙門氏菌，檢出線為10 CFU/mL，檢測時間為3h。CrociL等人在對豬肉樣品的檢測中，將 ELISA 方法和 PCR 法、平板計(jì)數(shù)進(jìn)行對比，得出前面兩者都較為靈敏，最低檢出線為1-10個/25g，檢測結(jié)果符合 ISO 規(guī)定。

免疫磁珠法免疫磁珠技術(shù)可以快速的富集乳制品中低濃度的菌，通過結(jié)合 PCR、ELISA等方法可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的檢測目的。呂琦等人通過對 4 中菌保守序列基因設(shè)計(jì)引物，建立多重 PCR 體系，在7-8h檢測時間內(nèi)，檢測靈敏度達(dá)到 102CFU/mL，具有特異性。免疫磁珠技術(shù)檢測在各個方面都表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，改進(jìn)得到嗜冷菌的保守序列能表現(xiàn)高通量性。對于免疫磁珠技術(shù)檢測乳制品中菌濃度的研究報(bào)道較少，但是應(yīng)用于檢測有害化合物的研究都比較成熟，應(yīng)用廣泛2。