[科普中國(guó)]-探索微觀世界的神器——超分辨顯微成像技術(shù)

**引言：**2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了三位科學(xué)家：Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，以表彰他們?cè)诔直鏌晒怙@微鏡領(lǐng)域做出的貢獻(xiàn)。超分辨熒光顯微技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域具有重要意義，但超分辨有什么優(yōu)點(diǎn)，起到什么作用，怎樣實(shí)現(xiàn)超分辨？這些問(wèn)題，讓我們來(lái)為大家一一解答。
圖1 2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主圖片來(lái)源：http://www.nobelprize.org/
一沙一世界，一花一菩提——生命科學(xué)都做些什么 每個(gè)生物個(gè)體都是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，以身高170厘米的小明為例，他的手部表面覆蓋著皮膚（組織），皮膚由細(xì)胞組成，細(xì)胞內(nèi)含有細(xì)胞核（細(xì)胞器），細(xì)胞核的核仁里含有遺傳物質(zhì)DNA（分子），分子是化學(xué)過(guò)程和生命過(guò)程的最小單元。生命科學(xué)從微觀層面觀察生命過(guò)程，大到組織和細(xì)胞，小到蛋白質(zhì)、DNA、RNA等化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)研究它們?cè)谏^(guò)程中的變化，揭示生命的物質(zhì)基礎(chǔ)和基本現(xiàn)象。從尺度上來(lái)說(shuō)，組成小明身體的細(xì)胞平均尺寸大約幾十微米，而最大的分子——蛋白質(zhì)的尺寸只有幾十納米，相當(dāng)于他身高的1/107。 孔子告訴我們，工欲善其事，必先利其器。細(xì)胞和分子這么小，想要看到它們，需要顯微成像技術(shù)的幫助。
圖2 將人放大數(shù)百萬(wàn)倍，“看到”另一個(gè)精彩的世界圖片來(lái)源：維基百科
盲人摸象與隔岸觀火——原子力探針顯微與光學(xué)探針顯微 顧名思義，顯微成像是一種觀察微小物體的手段。原子力探針和光學(xué)探針是兩種常用的顯微技術(shù)，前者就像盲人摸象，利用一個(gè)微小的探針接近樣品，通過(guò)反饋的作用力來(lái)實(shí)現(xiàn)觀測(cè)，這種觸摸的方式只能探測(cè)樣品表面，還會(huì)對(duì)脆弱的樣品造成損傷，不適用于觀察生命過(guò)程；相比之下，光學(xué)探針顯微就像隔岸觀火，把探測(cè)用的光束打到物體上，通過(guò)收集透射或者反射光的方式來(lái)進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)樣品的影響很小。
圖3 兩種常見(jiàn)的顯微鏡圖片來(lái)源：維基百科
為了提高光學(xué)顯微的成像效果，以便從復(fù)雜的細(xì)胞組織中提取出自己想要的細(xì)節(jié)，科學(xué)家還采用了熒光標(biāo)記的方法，在細(xì)胞中加入特殊的熒光標(biāo)記物，這些標(biāo)記物在特定的光照下，有的發(fā)出紅光，有的發(fā)出綠光，而且每種熒光標(biāo)記物都具有一定的選擇性，只與細(xì)胞中既有的特定分子結(jié)合，然后發(fā)出熒光。熒光成像大大提高了光學(xué)顯微成像的對(duì)比度，還幫助科學(xué)家分辨細(xì)胞中的不同結(jié)構(gòu)。圖中所示是牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，線(xiàn)粒體呈現(xiàn)紅色，微絲呈現(xiàn)綠色。然而光學(xué)顯微也有自己的缺陷——就像用望遠(yuǎn)鏡看天上的星星，即使再先進(jìn)的、口徑再大的望遠(yuǎn)鏡，也沒(méi)法看清所有星星；顯微成像的分辨能力也受到光學(xué)成像系統(tǒng)的限制，這種限制來(lái)自于光的衍射，因此被稱(chēng)作衍射極限。
圖4 牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞圖片來(lái)源：維基百科
墓碑上的公式——衍射極限 波動(dòng)性是光的基本特性之一，由此產(chǎn)生的衍射效應(yīng)始終困擾著包括顯微、望遠(yuǎn)在內(nèi)的光學(xué)成像系統(tǒng)。德國(guó)物理學(xué)家Ernst Abbe發(fā)現(xiàn)了顯微鏡的衍射極限，并將公式刻在自己的墓碑上。這里我們不去詳細(xì)分析衍射極限的成因，只需要大家知道這樣一個(gè)結(jié)論：由于衍射極限的存在，顯微成像系統(tǒng)的照明光只能在樣品上形成有限小的圓形光斑，被稱(chēng)作艾里斑；同樣地，樣品上的分子只能在成像相機(jī)上形成有限小的圓斑。從成像的角度來(lái)說(shuō)，衍射極限影響下的顯微成像系統(tǒng)只能分辨有限小的細(xì)節(jié)，一般在200納米到300納米之間。 前面已經(jīng)說(shuō)過(guò)，細(xì)胞的直徑大約幾十微米，想要研究細(xì)胞內(nèi)的生命過(guò)程，至少要能看清細(xì)胞器才行。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率用來(lái)看細(xì)胞還馬馬虎虎，對(duì)細(xì)胞器就只能看個(gè)大概，沒(méi)法滿(mǎn)足生命科學(xué)研究的需求。近年來(lái)，科學(xué)家們從不同的角度入手，實(shí)現(xiàn)突破衍射極限的光學(xué)顯微成像，也就是文章開(kāi)頭提到的超分辨熒光顯微鏡。超分辨的實(shí)現(xiàn)途徑很多，有結(jié)構(gòu)光照明（SIM）、受激發(fā)射損耗（STED）、光激活定位顯微（PALM）、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)（STORM）等，限于篇幅我們只講獲得諾貝爾獎(jiǎng)的兩種——Stefan W. Hell的受激發(fā)射損耗（STED）和Eric Betzig、William E. Moerner的光激活定位顯微技術(shù)（PALM）。
圖5 衍射極限限制了顯微鏡的分辨能力圖片來(lái)源：維基百科、果殼網(wǎng)
管中亦可窺豹——受激發(fā)射損耗顯微鏡 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡采用寬場(chǎng)成像的方式，照明光一次照亮整個(gè)成像范圍，然后用相機(jī)對(duì)整個(gè)成像范圍進(jìn)行曝光成像，一次獲得整幅圖像。“管中窺豹”型的掃描成像則有所不同，照明光聚焦在樣品上，形成一個(gè)極小的光點(diǎn)——也就是所謂的“管”，每次只對(duì)光點(diǎn)對(duì)應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行成像；當(dāng)我們改變光點(diǎn)的位置，使它依次掃遍整個(gè)樣品，也就獲得了一幅完整的圖像。有人要問(wèn)了，即使采用“管中窺豹”的方式，每次聚焦的光點(diǎn)依然受到衍射極限限制，系統(tǒng)分辨能力比起所謂的寬場(chǎng)成像沒(méi)有提高，掃描過(guò)程又增加了系統(tǒng)的復(fù)雜度，不是自找麻煩嗎？Stefan W. Hell的回答很簡(jiǎn)單：只要設(shè)法縮小“管中窺豹”的“管”，就能提高系統(tǒng)的分辨能力，實(shí)現(xiàn)超分辨。 通常的熒光成像是這樣的：熒光分子在吸收了照明光（或者叫激發(fā)光）A之后，會(huì)在很短的時(shí)間持續(xù)發(fā)出熒光B。掃描成像系統(tǒng)的分辨能力取決于A在樣品處的聚焦光點(diǎn)大小。Hell找到了熒光的開(kāi)關(guān)——第三種光C，在C的照射下，熒光分子即使吸收了激發(fā)光A，也沒(méi)法再發(fā)出熒光B。Hell讓開(kāi)關(guān)C同樣打在樣品上，形成一個(gè)四周亮、中心暗的“面包圈”，“面包圈”中心的暗區(qū)域比艾里斑還要?。蝗缓蟀衙姘μ自诎锇呱?，就像在“管”的出口又加了一個(gè)小孔，使“管”的直徑大大減少，也就提高了整臺(tái)顯微鏡的分辨能力。
圖6 “面包圈”限制了激發(fā)光A的有效范圍
“我只看到星星”，“我看到了銀河”——光激活定位顯微 熒光分子是熒光樣品的最小發(fā)光單元，由于衍射極限的限制，在相鄰的兩個(gè)熒光分子同時(shí)點(diǎn)亮?xí)r，我們只能看到一個(gè)光斑，但如果每次只點(diǎn)亮一個(gè)分子，就可以通過(guò)光斑，計(jì)算得到熒光分子的準(zhǔn)確位置。 Eric Betzig和William E. Moerner采用的就是這樣一種方法，如果說(shuō)STED技術(shù)核心是“擦除”，那么PALM技術(shù)的核心就是“定位”：Moerner發(fā)現(xiàn)存在光D可以“打開(kāi)”熒光。通過(guò)控制D的照射劑量，保證每次只有少量熒光分子處在打開(kāi)狀態(tài)；當(dāng)熒光分子在開(kāi)與關(guān)之間切換時(shí)，整幅圖像中的熒光信號(hào)就會(huì)像銀河中的星星一樣亮暗閃爍，只要進(jìn)行足夠多次的開(kāi)關(guān)和成像，就可以組合出整個(gè)樣品的圖像。
圖7 溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結(jié)果。（左）傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像；（中）光激活定位顯微鏡成像；（右）放大的光激活定位顯微鏡成像。圖片來(lái)源： 果殼網(wǎng)
集百家之長(zhǎng)，成一家之言——交叉學(xué)科的勝利？ 作為光學(xué)發(fā)展史上的重大進(jìn)步，衍射極限的突破顯然是一個(gè)物理學(xué)問(wèn)題，三位科學(xué)家以化學(xué)方法為工具，突破衍射極限并摘走了2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，由此受益最大的則是生物學(xué)。更有趣的是，三位諾貝爾獎(jiǎng)得主都是物理學(xué)出身，因此超分辨顯微成像技術(shù)可以稱(chēng)得上是交叉學(xué)科的重大勝利。隨著超分辨技術(shù)的發(fā)展與成熟，國(guó)際上主流研究方向已經(jīng)由系統(tǒng)本身轉(zhuǎn)向應(yīng)用，幾大顯微公司也紛紛推出各自的商業(yè)化產(chǎn)品，但空間與時(shí)間、成本與性能的博弈還在持續(xù)，在可以預(yù)見(jiàn)的將來(lái)，超分辨顯微成像技術(shù)仍有進(jìn)步的余地。