[科普中國]-TA有望解決角膜供體不足難題

一直以來，科學工作者們不斷努力，攻破了臨床醫(yī)學上的一個又一個難題，為以往難以治療的疾病帶來了治愈的希望。近日，全球首例使用iPS細胞進行角膜再生的臨床移植手術在日本大阪大學成功進行，該研究為角膜疾病患者帶來了新的曙光。

日本國立動物醫(yī)院對小型動物進行眼角膜移植前后的對比照片和染色照片

（圖片來源：https://www.cellseed.com/product/img/CellSeed_New_Brochure01.pdf）

供體短缺——角膜移植的“攔路虎”

角膜是眼球前部的透明圓頂狀膜。這個半毫米厚，一厘米直徑的薄膜，組成了完整的眼外壁，具有強大的聚焦功能，其作用包括透光、折射光和防止異物進入等。當角膜由于炎癥、外傷或者遺傳疾病等因素變得混濁、不能正確折射光線或者有孔破損時，視力將嚴重受損，甚至致殘致盲。角膜病是僅次于白內障的第二大致盲眼病，患者人數(shù)眾多。目前，角膜移植手術是治療與角膜相關疾患的有效方法。

人體眼球結構示意圖，作者：Rhcastilhos

（圖片來源https://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%A7%92%E8%86%9C）

然而，角膜移植最大的問題便是供體的缺乏。角膜移植需要去除失去功能的角膜，并縫制新的供體角膜。通過角膜移植可以治愈75%的角膜疾病。由于角膜上沒有血管、淋巴，移植后機體免疫排斥反應相對較低，也不需要血液型配對。因此，相比技術而言，供體角膜的短缺是阻礙患者重見光明的主要因素。

現(xiàn)階段，角膜主要供體來自于死者捐獻。據統(tǒng)計，中國有400-500萬左右的角膜疾病患者，其中能得到角膜移植的患者不足1萬人，甚至不到患者總人數(shù)的百分之一。日本每年有2萬只眼睛需要移植角膜，而實際上能夠進行手術的供體數(shù)量只有1400片。

對于一些急性角膜疾病患者來說，如果不能在3-5天內得到新鮮的角膜，會導致角膜穿孔感染，進而導致視網膜受損，到最后很可能必須摘除眼球。在中國，由于供體嚴重不足，如果不是急性患者一般都要等上1-3年。很多病人因此延誤治療時機，造成終生失明的遺憾后果。

豬角膜代替人角膜解決供體問題？免疫排斥來攪局

鑒于角膜移植存在嚴重的供體短缺問題，科學工作者始終致力于尋求別的方法和技術來代替新鮮的人體角膜。

人們首先想到的解決方案是動物角膜，最常用的是豬角膜。豬角膜在形態(tài)上與人角膜的相似度可以達到94%。然而，由于是“異種異體移植”，免疫排斥問題將十分嚴重。同時，如何去除豬角膜上攜帶的各種病原菌、寄生蟲等微生物仍然是一個有待研究的問題。

相比豬角膜移植術，人工眼角膜作為另一種解決方案無疑獲得了更超前的進展。2018年6月，英國紐卡斯爾大學的研究者們用3D打印技術造出世界首例人工眼角膜。他們用健康人角膜中提取出的干細胞，混合膠原蛋白和藻酸鹽，僅用10分鐘就得到和患者同樣尺寸和大小的人工眼角膜。盡管該技術應用了人體來源細胞，有望抑制排異反應，但是由于缺乏確實的體內實驗，這項新技術用于臨床研究仍然需花上數(shù)年的時間。

NEWCASTLE UNIVERSITY

（圖片來源 https://www.huffingtonpost.jp/2018/06/03/3d-print-cornea_a_23449897/）

什么是iPS細胞？

iPS細胞(induced pluripotent stem cells)，全稱人工多能干細胞，是將皮膚，血液，尿液等中提取的體細胞，經過多能性誘導因子的導入、培養(yǎng)，所制成的具有分化成人體各種組織臟器并能無限增殖的細胞。iPS用于臨床最大的優(yōu)勢即是可以“同種同體移植”，從而最大程度減少免疫排斥。

iPS細胞的全能分化能力（示意圖）

（圖片來源：維基百科）

iPS****細胞由來的角膜如何用于移植？

由iPS由來的角膜細胞也屬于生物工程類人工眼角膜。就在不久前，日本大阪大學醫(yī)學院的西田幸二教授領導的研究小組宣布他們利用iPS細胞制成的眼角膜完成了世界首例iPS眼角膜移植手術。

今年7月，他們將iPS由來的角膜上皮細胞薄片給患有角膜上皮干細胞缺乏癥的患者進行了移植。這種疾病的致病原理是：富含角膜上皮干細胞的角膜邊緣部，由于燙傷，酸堿腐蝕，Stevens-Johnson癥候群（一種罕見的皮膚黏膜壞死癥）等原因，角膜上皮干細胞部分甚至完全缺失。其后果是結膜上皮侵入角膜內，血管等結膜組織覆蓋在角膜上層導致角膜呈現(xiàn)重度渾濁，引起視力障礙和失明。

移植手術于今年七月在大阪大學醫(yī)學院成功實施，患者視力得以恢復，已于8月23日出院。如果該患者預后良好，視力得以長期保持，則年內還會進行第二例移植手術。

西田幸二教授召開關于首例使用iPS細胞進行角膜移植手術的記者招待會

（圖片來源：https://www.nikkei.com/article/DGXMZO49163170Z20C19A8000000/）

由iPS細胞如何得到角膜薄片呢？首先選擇和患者具有同一HLA型（人白血球型抗原，是人體識別自身和異己的最主要因子，在臟器移植時HLA匹配度高的患者，移植的成功率也越大）的健康人的iPS細胞，再將這個iPS細胞株，用西田教授小組開發(fā)的SEAM法（self-formed ectodermal autonomous multi-zone自我形成的眼外細胞的外胚層自主多區(qū)法）進行分化，以得到角膜上皮前體細胞。

角膜上皮細胞薄片的制作 （圖片來源：Nature 2016. Nat Protoc 2017）

如下圖所示，利用這項技術，經過40天的人工培養(yǎng)，iPS分化成同心圓細胞層。這個同心圓細胞層幾乎完全再現(xiàn)了眼睛的多層結構特征，包括表皮，角膜上皮，晶狀體，神經視網膜和視網膜色素上皮層。下圖中第三層外緣就是我們想要的角膜上皮細胞。之后再將這部分細胞從中分離出來并加以純化。

由iPS細胞分化成的四層眼前體細胞，這些細胞是胚胎發(fā)育初期，形成眼部結構的初期細胞，包括表面外胚葉、眼表面外胚葉、晶狀體、眼杯、神經外胚葉細胞。這些細胞隨著胚胎的發(fā)育會依次形成構成表皮、角膜上皮、晶狀體、視網膜、網膜色素上皮、以及視神經等成熟細胞。

（圖片來源：https://www.jst.go.jp/pr/announce/20160310/index.html）

接著，再將分離純化后的角膜上皮前體細胞進行擴大培養(yǎng)，令角膜上皮細胞自行生成多層結構，當達到一定的厚度時，即可用于移植手術。

（圖片來源：https://www.jst.go.jp/pr/announce/20160310/index.html）

除了從iPS細胞獲得高濃度有活性的角膜上皮細胞層這個技術難關外，另一個需要解決的難題是怎樣回收這個角膜細胞層。為了從平面培養(yǎng)皿上獲得一個完整的多層細胞結構而不破壞生長中的新鮮細胞，科研工作者付出了艱辛的勞動。

如下圖所示，當使用通常的細胞培養(yǎng)皿和胰蛋白酶進行細胞分離時，細胞會被分散成各自獨立的細胞。好不容易得到的多層角膜層不能保持完整的結構，當然也不能用于移植。因此，科研人員嘗試在普通的培養(yǎng)皿表面涂上對溫度敏感的化學聚合物（PIPAAm），希望僅通過溫度變化就實現(xiàn)細胞薄層的分離。當溫度在37度時，這些聚合物和細胞緊密結合，當溫度從37度降到20度左右時，這些化學聚合物發(fā)生變性，和細胞之間的結合能力變弱，由此即可輕松獲得完整的細胞薄片。

（圖片來源： https://www.funakoshi.co.jp/contents/67935）

iPS****細胞治療眼部疾病已獲豐碩成果

iPS細胞在眼部疾病上的臨床應用，除了這次角膜移植手術，在2018年日本已經實施了iPS由來的細胞對視網膜黃斑變性的臨床治療。和這次的方法有所不同的是，由iPS細胞分化得到的視網膜細胞當時是以懸浮液的狀態(tài)注射到患者的眼中進行的。

這項研究由日本理化學研究所高橋教授領導的研究小組進行，他們在2017年3-9月間，將25萬個由iPS分化得到的網膜細胞移植到60-80歲的5位男性眼內。之后為期1年的安全性追蹤結果顯示，移植細胞沒有在患者體內形成腫瘤等嚴重不良反應，5人中有一人有輕微的排斥反應，已通過藥物治療得以緩解。5人至今都較好地維持了視力，這也證明了iPS細胞由來的組織細胞在再生治療上的安全性。我們期待iPS由來的角膜薄片，也能安全穩(wěn)定地在患者身上持續(xù)發(fā)揮作用。

自山中伸彌教授發(fā)現(xiàn)iPS細胞以來，日本就將iPS在再生醫(yī)療方面的應用列為國家重點發(fā)展領域。目前在日本，不僅僅是醫(yī)學界，生物界，材料工學界，甚至各大藥企都聯(lián)合起來，全力推動iPS的產業(yè)化發(fā)展。借助產學研的通力合作，如果可以實現(xiàn)iPS角膜薄片的工業(yè)化生產，角膜供體不足的問題將會得到根本性地解決，會有更多的角膜疾病患者得以重見光明。

參考文獻

[1]Ryuhei Hayashi & Kohji Nishida et al.Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature volume531, pages376–380 (17 March 2016)

[2]3D打印機制作眼角膜

https://idarts.co.jp/3dp/famu-3d-printing-cornea-technology/

[3] Hayashi R et. al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells 2017 Nature Protocols

[4] Cell sheet engineering, Masayuki Yamato,Teruo Okanoa.MaterialsToday,Volume 7, Issue 5, May 2004, Pages 42-47