[科普中國]-免疫色譜法

定義

免疫色譜法是基于具有高度親和性和專一性的特異性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，將抗原或是抗體偶聯(lián)到柱填料中制備親和層析柱，樣品通過層析柱，即可快速而高效的從復(fù)雜的混合樣品中分離純化出與抗原或抗體互樸的特定的免疫成分，是選擇性最髙和最有效的分離純化方法，且具有專一分離純化特異性抗體的能力。

近30年免疫色譜法得到迅速發(fā)展，在分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，成為一種安全、快速、高效的免疫學(xué)檢測技術(shù)。1

免疫親和柱的制備抗原或抗體的制備與純化成功的免疫親和依賴于特定性質(zhì)的抗原或抗體的選擇，高度被純化的抗原或抗體能夠提供高度特異性配基來純化抗體或抗原。配基溶液的濃度和純度嚴重制約著親和純化的效果，選擇和制備親和柱的配基要兼?zhèn)涓呒兌?、髙活性和髙度特異性。2

載體的選擇免疫親和層析的成功與否很大程度上取決于選擇一個合適的載體，理想的載體應(yīng)具有以下性質(zhì)；

①具有大量可供活化的能與配基特定結(jié)合的化學(xué)基團，并且在溫和條件下能夠與大量的配基反應(yīng)連接而不破壞配基性質(zhì)。

②載體必須具有較好的物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物惰性,可耐受偶聯(lián)、親和、洗涂、洗脫、平衡等各操作條件下的處理而不改變其結(jié)構(gòu)、硬度、膨脹度等，非特異性吸附現(xiàn)象盡量不發(fā)生。載體需具備良好的機械性能，耐受較寬pH及離子強度、顆粒均勻、膨脹性能好,常用的載體有瓊脂糖凝膠、纖維素、聚己稀凝膠及聚丙爍酌胺凝膠等等。

③載體必須有特定的結(jié)構(gòu)(稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))能使配基大分子自由進入而増加親和層析柱中配基的有效濃度。商度多孔性質(zhì)使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠保證各類大小分子的自由流動，也間接提高了配基及配體的親和有效濃度，使免疫親和體系更趨近于溶液中的反應(yīng)狀態(tài)。

④載體需具有離度的親水性及水不溶性，載體的親水性能夠在一定程度上保證被免疫親和吸附的生物分子的穩(wěn)定性，還可有效減少因疏水作用等其他作用造成的非特異性吸附，保證親和反應(yīng)平衡。2

抗原或抗體與載體的結(jié)合抗原或抗體要偶聯(lián)到載體上,需要先將載體的功能基困活化,再進行偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)必須在不致使破壞取基的理化性質(zhì)的溫和條件下進行,偶聯(lián)后多次洗涂載體，除去未偶聯(lián)到載體上的抗體，另需測定偶聯(lián)的配基量，計算偶聯(lián)率。2

應(yīng)用免疫親和層析技術(shù)因其安全、簡便、可定呈定性分析等優(yōu)點，近20年來得到迅速發(fā)展，應(yīng)用范圍也日益擴大，國內(nèi)外已先后有文獻報道研制出免疫親和層析柱，如生長激素單克隆抗體免疫親和柱、黃曲霉素免疫親和柱、氛霉素免疫親和柱等，其應(yīng)用主要包括抗體抗原的分離純化,結(jié)合HPLC、GC等方法進行藥物檢測、激素檢測、農(nóng)獸藥殘留檢測及其他毒素檢測等等。2

展望免疫親和層析技術(shù)可從樣品粗提液中一次性簡單過柱處理即可分離出巧需的高純度特異性活性物質(zhì)，不但可分離樣品中含量極微的物質(zhì)，而且可分離性質(zhì)相近的目標物質(zhì)。當然，免疫親和層析也存在一些缺點，如當前載體發(fā)展不足導(dǎo)致價格昂貴，配基純度要求過高不易制備，洗脫過程中易造成目的物質(zhì)的失活等。制備免疫親和柱是較為昂貴的，雖巧其產(chǎn)物純度極高，但當前文獻報道親和柱結(jié)合容量相對偏低,因此在保證效率的前提下為了節(jié)約成本，通常制備的是容量小而粗的柱子。同時研究其柱容量、穩(wěn)定性、重復(fù)性、上樣條件、洗脫條件等也是必要的，多次利用分離純化更多的目的產(chǎn)物，且柱體短小可降低偶聯(lián)配基的丟失和損耗。

新種類柱填料和載體的研究開發(fā)，偶聯(lián)配基的高純度制備(抗原或抗體)及如何保證配基及目的產(chǎn)物在免疫親和層析過程中的活性不喪失，將會嚴重影響著該項技術(shù)的發(fā)展。2