[科普中國]-β-酪蛋白

定義

β-酪蛋白(β-CN)是由乳腺腺泡上皮細(xì)胞合成的磷酸化蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物(牛、牦牛、山羊、馬、兔等)和人的乳汁中。

β-酪蛋白(β-CN)家族至少能在七種哺乳亞綱和兩種有袋動(dòng)物中找到，其蛋白質(zhì)的氨基酸序列和核酸序列已被我們所知。人乳中級(jí)結(jié)構(gòu)已用埃德曼降解法確定，其序列與牛乳和羊乳蛋白序列比較，顯示有 50 %是相同的，序列數(shù)據(jù)也暗示著其基因的多態(tài)性。由于 β-CN 是人乳酪蛋白中主要的蛋白質(zhì)成分，因此有研究者認(rèn)為在嬰兒配方乳粉中強(qiáng)化 β-CN，可以使牛乳更接近人乳，從而縮小了牛乳喂養(yǎng)與母乳喂養(yǎng)的差距。另外，嬰兒使用強(qiáng)化了 β-CN 的嬰兒配方乳粉，可有效提高整體配方奶粉的易消化性。2

性質(zhì)和結(jié)構(gòu)β-CN 由 226 個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為 25 382 Da。β-酪蛋白含有大量的谷氨酰胺，此氨基酸序列是非常保守的，在N-末端附近形成了主要的磷酸化作用位點(diǎn)，β-酪蛋白磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量和磷酸化水平比α-酪蛋白少。在牛的β-酪蛋白中，一個(gè)完全磷酸化形式包含5個(gè)磷酸基團(tuán)，而在其他物種里，β-酪蛋白含有大量的磷酸化作用形式，如人、山羊和負(fù)鼠。Sood 比較了在 β-酪蛋白中含量較高的結(jié)合了兩個(gè)磷酸根的 β-酪蛋白(β-CN-2P)和結(jié)合了四個(gè)磷酸根的 β-酪蛋白(β-CN-4P)，結(jié)果顯示兩者約占 β-酪蛋白總量的70%，每個(gè)大約35 %。在 β-酪蛋白中脯氨?；?Proly-)有相當(dāng)高的頻率，因其實(shí)亞氨基酸，形成肽鍵后，不能參與氫鍵的形成，加上其 α-碳原子位于五元環(huán)上，兩側(cè)的鍵難于旋轉(zhuǎn)，不易形成 α-螺旋(α-Helix)，故脯氨酸是傾向于瓦解 α-螺旋和 β-片層結(jié)構(gòu)(β-Pleated sheetstructure)的。1

功能β-酪蛋白是人乳中的主要蛋白質(zhì)，是一種磷酸化蛋白。蛋白質(zhì)的磷酸化區(qū)域可與鈣離子結(jié)合，并且磷酸化程度越高結(jié)合鈣離子能力越強(qiáng)。據(jù)推測，人乳β-酪蛋白的磷酸化位點(diǎn)以及數(shù)量與酪蛋白和鈣離子結(jié)合數(shù)量等相關(guān)，也影響其他二價(jià)離子如鋅的吸收。在消化過程中，磷酸化的β-酪蛋白被降解成多種具有生物活性的肽段，并能夠引起行為、消化代謝、激素、免疫、神經(jīng)和營養(yǎng)等多方面的應(yīng)答。鈣離子與酪蛋白結(jié)合形成膠束,這使得它能更好地被嬰兒吸收。有研究表明β-酪蛋白能夠大大降低過敏性，并且它能夠影響新生兒的睡眠模式。除了具有非常優(yōu)秀的消化性，以及低過敏性之外還有其他的一些功能，比如β-酪蛋白具有抗高血壓的功能，因?yàn)樗谙^程中可以施放出抗高血壓的生物活性肽，它還有抗病毒的功能；具有抗菌性，能夠抑制細(xì)菌的生長，同時(shí)β-酪蛋白可以防止活性蛋白變異，亦可以促進(jìn)某些營養(yǎng)成分(如鈣、磷、必需氨基酸等)吸收。2

分離技術(shù)蛋白質(zhì)的分離純化可根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小、電荷量、溶解度以及親和性結(jié)合部位的有無，建立許多分離純化的方法。常用的有離心分離、沉淀分離、透析法、超濾法、層析分離、膜分離以及酶法分離等。這些分離純化蛋白質(zhì)的方法各有利弊。

離心分離離心分離是利用不同物質(zhì)之間的沉降系數(shù)或浮力密度等差異，用離心力場進(jìn)行的一項(xiàng)分離、濃縮或提煉的物理分離分析技術(shù)。2

沉淀分離沉淀分離是使用最廣泛的酪蛋白組分分離技術(shù)，它主要是利用各酪蛋白組分在不同濃度溶液中的溶解性以及對(duì)溫度、離子強(qiáng)度以及鈣離子的敏感性差異而實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)酪蛋白組分在不同濃度尿素溶液中的溶解度差異，Hipp 等人于 1952 年首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛乳 β-CN 和α-CN(包括 αs-CN 和 к-CN)分離，得率分別為 8 %和 45 %。Aschaffenburg等人于 1963 年結(jié)合等電點(diǎn)沉淀與尿素沉淀，對(duì) Hipp 的方法進(jìn)行了改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，獲得了純度更高的β-酪蛋白。2

層析分離層析法又稱色譜法，是一種物理化學(xué)分離分析方法，是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，使各組分不同程度分布在固定相和流動(dòng)相中，由于各組分受力不同從而使各組分以不同速度移動(dòng)達(dá)到分離。用于酪蛋白組分純化分離的色譜技術(shù)主要有離子交換色譜，疏水層析，吸附色譜，凝膠色譜，共價(jià)色譜以及親和色譜等。Thompson 于 1966 年使用 DEAE-纖維素，用 pH=7 的含巰基乙醇和尿素的緩沖液，采用氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫，成功分離出酪蛋白組分。Bramanti 等人于 2001 年，使用苯基分離了牛奶蛋白質(zhì)，蛋白樣品用 4 mol 硫氰酸胍進(jìn)行處理，在 30 min 內(nèi)從高鹽濃度的緩沖液(pH =7.2，含 1.8 mol 硫酸銨和 8 mol 尿素的 0.1mol 磷酸緩沖液)線性降低為低鹽濃度的緩沖液狀態(tài)(含 8 mol 尿素的磷酸緩沖液)，實(shí)現(xiàn)了對(duì) as-酪蛋白，β-酪蛋白和 к-CN 的分離。2

酶法分離酶是一種生物催化劑，能通過改變反應(yīng)的活化而加快或降低反應(yīng)速度，它本身不參與反應(yīng)，不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，因其具有高效性、轉(zhuǎn)移性、溫和性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用與食品工業(yè)中。Huppertz 等人利用 β-酪蛋白和 αs-酪蛋白在低溫的酸性條件下溶解度的不同，于 2005 年使用凝乳酶實(shí)現(xiàn)了對(duì) β-酪蛋白的富集分離。2

膜分離膜分離是根據(jù)生物膜對(duì)物質(zhì)選擇性通透的原理所設(shè)計(jì)的一種對(duì)包含不同組分的混合樣品進(jìn)行分離的方法。膜分離技術(shù)具有分離、純化、精制以及濃縮蛋白的功能，既高效環(huán)保又易于操作，目前已成為一種重要的分離技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于食品藥品、生命科學(xué)、化工冶金等重要領(lǐng)域，具有很高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。Agronomique 等人于 1986 年應(yīng)用微濾技術(shù)生產(chǎn)了 β-酪蛋白。Akgol 于 2008 年，用聚酰胺纖維膜和活性綠-4B 染料制成親和膜，在 pH=5 條件下吸附初步純化的 β-酪蛋白，之后用含 1.0 mol 氯化鈉或含 0.5 mol 硫氰酸鈉的 Tris-HC1 緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，成功獲得了純度更高的 β-酪蛋白。2