[科普中國]-生物毒素形態(tài)分析

生物毒素是一類具重要的生物源化學物質(zhì)，具有廣泛的民用價值和軍事意義。生物毒素形態(tài)分析可以采用理化分析法、免疫學方法、高效液相色譜法等方法。

生物毒素生物毒素(biological toxins)是生物機體分泌代謝或半生物合成產(chǎn)生的、不可自復制的有毒化學物質(zhì)，包括動物、植物、海洋生物和微生物等產(chǎn)生的對其它生物物種有毒害作用的各種化學物質(zhì)。生物毒素的研究具有廣泛的民用價值和軍事意義。作為治療藥物、抗癌導向藥物和預防疫苗，生物毒素及其作用機理、效力等的研究尚在積極的探索之中；由于生物毒素毒性較高，可發(fā)展成為一種潛在的生物武器，對人類健康和國家安全構(gòu)成了潛在的巨大威脅。因此，生物樣品和環(huán)境樣品中痕量生物毒素的檢測已成為各國關(guān)注的重點，發(fā)展毒素的檢測、鑒別和防護手段也成為當前國際反恐工作的迫切需要。生物毒素的分析檢測早期主要通過動物實驗、常規(guī)免疫方法及普通理化分析手段等進行。近年來，隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，生物質(zhì)譜、色譜質(zhì)譜聯(lián)用和各類新型傳感技術(shù)越來越多地應用于生物毒素的檢測中，使生物毒素的定性與鑒別更加準確，分析的靈敏度和特異性也有很大地提高。

海洋生物毒素——河豚毒素和石房蛤毒素
河豚毒素(tetrodotoxin, ttx)屬于小分子非蛋白質(zhì)類神經(jīng)性毒素，分子式c11h17n3o8，分子量319.3， ld50(半數(shù)致死量)為8 μg/kg(小鼠，ip.)，曾一度被認為是自然界中毒性最強的非蛋白類毒素。有報道稱在歐洲捕撈的海螺引發(fā)了河豚毒素中毒事件，該種屬的海螺ttx含量驚人，1只可致10個成年人死亡。ttx不溶于有機溶劑，易溶于有機酸和無機酸水溶液，ph 3～7，對熱穩(wěn)定，在強酸強堿條件下不穩(wěn)定，主要降解產(chǎn)物為c9堿。
石房蛤毒素(axitoxin, stx)屬麻痹性貝毒素(psp)。它是海洋生物中毒性很高的小分子麻痹性神經(jīng)毒素，小鼠ld50為8 μg/kg。其分子式為C10H17N7O4，分子量299。純品為白色固體，易溶于水，不易被消化酶破壞。石房蛤毒素主要作用于突觸前膜，可阻斷突觸后膜的Na+通道，導致一系列的中毒癥狀。

生物測定法
細胞毒性法是檢測stx常用生物測定法之一，主要基于stx作為鈉通道阻斷劑對細胞生物活性的影響實現(xiàn)檢測。okumura等通過加入刺尾魚毒素（maitotoxin），將孵育時間從1～2 d降至6～8 h，實現(xiàn)了快速細胞生物分析。應用神經(jīng)瘤細胞建立的psp的體外檢測模型，測得幾種psp的毒性大小為：stx > dcstx > neostx > gtx1,4 > dcneostx > gtx2,3 > dcgtx2,3 > gtx5。

理化分析法
沈曉書等在ttx的熒光檢測法中應用微波輔助堿解法提高ttx的水解速度和c9堿的產(chǎn)率。在堿解體系中，以水和異丙醇作為混合溶劑使熒光強度得到顯著提高，該方法可檢測16 μg/l ttx。
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(lcms)可對ttx直接進行檢測。對于全血和尿液等生物樣品，以c18或活性炭固相萃取柱對樣品進行預處理，結(jié)合液相色譜-電噴霧串級質(zhì)譜(lc-ms/ms)可檢測低于10 μg/l的ttx。gc-ms方法則需將ttx降解成為c9堿并對其進行衍生化方可檢測，檢出限(lod)可達1 ng。

免疫學方法
常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)主要基于游離的ttx競爭抑制以堿性磷酸酶(ap)標記的mab與檢測抗原的結(jié)合反應，最新報道則以堿性磷酸酶標記ttx，通過直接競爭免疫抑制法實現(xiàn)對ttx的檢測，其檢測靈敏度為2 μg/l。免疫親和柱層析法通過抗原抗體的特異性結(jié)合實現(xiàn)ttx的捕獲和富集，親和柱上洗脫的ttx與其mab的結(jié)合產(chǎn)物以高效液相色譜-熒光檢測器(hplc-fld)檢測，lod為2 μg/l。
各種基于免疫學原理的新型傳感器相繼用于ttx的檢測?；诒砻娴入x子體共振技術(shù)(spr)的傳感器是將具有特異識別屬性的分子(即配體)固定于金屬膜表面，監(jiān)控體系中被分析物與該配體特異性結(jié)合導致的金屬膜表面體系的折射率發(fā)生變化，從而實現(xiàn)檢測，具有無需標記，快速靈敏等優(yōu)點。將ttx化學鍵合在自組裝單分子層膜(sam)修飾的金膜表面以抑制法測定定量ttx抗體與樣品中ttx結(jié)合后剩余的ttx抗體，從而實現(xiàn)對ttx的定量檢測。該方法ic20(20%抑制濃度)和ic50(50%抑制濃度)處的lod分別為0.3和6 ng/l。電化學免疫傳感器結(jié)合了電化學放大作用與免疫電極的特異性。在一次性絲網(wǎng)印刷碳電極上覆蓋bsattx包被物，然后加入游離的ttx和堿性磷酸酶標記的ttx mab，特異性結(jié)合引起的電流變化以安培計檢測，從而間接求得ttx含量。該方法最低可檢出16 ng/l的ttx。

真菌毒素——黃曲霉毒素和t2毒素
黃曲霉毒素(aflatoxin, af)是一種雜環(huán)分子，具有強致癌力。其作用的靶器官主要為肝臟，可導致肝細胞癌變。afb1是全部黃曲霉毒素的亞型中毒性最強的，小鼠ld50為9 mg/kg，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐熱能力強，是已發(fā)現(xiàn)真菌毒素中最穩(wěn)定的一種，但易被堿或強氧化劑破壞。
t2毒素(t2 toxin)是單端孢霉烯族毒素之一，屬a型單端孢霉烯。分子式：c24h34o9；分子量：466.2。不同種動物ld50范圍在1.0～14.0 mg/kg體重。t2毒素主要作用于增殖活躍的細胞，對淋巴細胞的損害最為嚴重。t2毒素純品為白色針狀結(jié)晶，易溶于有機溶劑，不易溶于水。其性質(zhì)穩(wěn)定，僅堿性條件下次氯酸鈉可使之失去毒性；環(huán)氧基團和雙鍵被認為是活性單位。

高效液相色譜法
高效液相色譜法(hplc)是檢測真菌毒素的常用方法之一。應用熒光衍生化試劑蒽腈對t2毒素進行柱前衍生化，以免疫親和色譜柱分離，lod為5 μg/kg(谷粒)，回收率80%。氣相色譜質(zhì)譜法(gc-ms)是t2毒素應用最廣泛最靈敏的檢測方法，可以同時檢測幾種不同類型的單端孢霉烯族毒素，在多種毒素混合污染時更具獨特的優(yōu)越性。采用ncigcms可檢出低至1 fg的t2毒素。本實驗室對鐮狀鐮刀菌菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)物中的有毒代謝產(chǎn)物采用gc-ms鑒別，并對其中的主要毒素采用單離子選擇模式進行了定量分析。以c18作為分散材料的基質(zhì)固相分散法對油性基質(zhì)進行預處理，無需后續(xù)處理即可去除基質(zhì)中的油脂。結(jié)合lc-esi-ms/ms分析預處理后的樣品，可同時檢測4種亞型的黃曲霉毒素b1、b2、g1和g2，lod為20～90 ng/kg。

免疫學方法
免疫層析法結(jié)合了免疫的高特異性和層析法快速簡便的特點，樣品借助毛細作用在條狀纖維制成的膜上泳動，黃曲霉毒素被固定于膜上特定區(qū)域的含有膠體金探針的抗體捕獲并富集，以纖維膜上顯色條的有無或多少來定性或定量，幾分鐘便可得到直觀結(jié)果。該金標試紙條可檢測食物中2 μg/kg的黃曲霉毒素，準確率大于95%。熒光偏振免疫測定法[16]基于毒素與抗體結(jié)合后分子質(zhì)量增大，分子旋轉(zhuǎn)速度降低從而導致熒光偏振值增大的原理，熒光標記的毒素在樣品中同無熒光標記的毒素與特異性抗體競爭性結(jié)合，通過測定熒光偏振值的變化實現(xiàn)檢測。該方法可檢測不同谷物中低至5 μg/l的afb1，但與b2、g1和g2亞型有約30%的交叉反應。
對于海洋生物毒素和真菌毒素等小分子毒素，生物測定法、組織培養(yǎng)法以及薄層色譜法等由于檢測成本低，對設備要求不高等特點，在基層實驗室檢測中仍有廣泛應用。氣相、液相等色譜方法不僅在定量分析中具有較大優(yōu)勢，在選用合適的檢測器(如fld)和樣品預處理方法(如柱前衍生化)后可成為檢測小分子毒素最靈敏的方法之一。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在定量檢測的同時可對毒素進行準確的定性鑒別，成為科研和實驗室檢測的主流方法。免疫層析法和熒光免疫法等技術(shù)將免疫檢測的高特異性與光譜法的高靈敏度或色譜法的分離、富集作用有效整合在一起，可對小分子生物毒素進行快速、準確的鑒別，成為現(xiàn)場快速偵檢和篩查的主要手段1。

動物毒素——蛇毒
蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液中毒性成分的總稱，主要含有4類物質(zhì)：酶、神經(jīng)毒性多肽、神經(jīng)生長因子和膜活性多肽，其中神經(jīng)毒性多肽被稱為蛇毒素。新鮮的毒液呈蛋清樣粘稠液體， 弱酸性，常溫下易失活。經(jīng)甲醛處理失去毒性，但仍保持其抗原性。α-銀環(huán)蛇毒素的ld50(小鼠，ip.)為0.128 mg/kg。

生物質(zhì)譜法
生物質(zhì)譜的優(yōu)點在于能夠準確測定蛇毒蛋白的氨基酸序列，從而實現(xiàn)對不同種屬的蛇毒進行種間鑒別。應用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜-檢測-蛇毒蛋白，最低定量限為10 ng。以凝膠滲透色譜和反相hplc-將有效肽段從3種蛇毒中分離出來。

免疫學測定法
光學免疫分析(oia)基于spr原理，將單分子層薄膜涂在硅芯片基質(zhì)表面，蛇毒與薄膜的特異性結(jié)合會導致入射白光產(chǎn)生金黃色至藍紫色的反射光。該方法可對血、尿等生物樣品中的4種類型的蛇毒的原型同時進行定性和半定量檢測，lod為0.2～1.6 μg/l。熒光免疫技術(shù)結(jié)合了熒光檢測的高靈敏度和免疫法的高特異性，以聚苯乙烯微球為載體，半導體量子點為熒光標記試劑，將蛇毒抗體固定于表面羧基化的具有不同顏色的微球上，加入蛇毒使之與抗體結(jié)合，再加入結(jié)合有量子點的蛇毒抗體，與蛇毒結(jié)合形成抗體-抗原-抗體復合物，實驗結(jié)果可通過紫外顯微鏡直接觀測。該方法對naja kaouthia蛇毒的lod為5～10 μg/l2。

本詞條內(nèi)容貢獻者為:

梁志宏 - 副教授 - 中國農(nóng)業(yè)大學