[科普中國(guó)]-熒光免疫層析技術(shù)

熒光免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以固定有檢測(cè)線(xiàn)(包被抗體或包被抗原)和質(zhì)控線(xiàn)(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記抗體或抗原固定于連接墊，通過(guò)毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)。對(duì)于帶有多個(gè)抗原決定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法，即待測(cè)物在流動(dòng)相作用下先與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線(xiàn)時(shí)再與包被抗體結(jié)合形成雙抗夾心的“三明治”型。

免疫層析技術(shù)(ImmunochromatographicAssay，ICA)是20試劑末發(fā)展起來(lái)的結(jié)合免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)的一種分析方法，該方法具有特異性、操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等重要領(lǐng)域。傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，通過(guò)條帶顯色對(duì)目標(biāo)物定性檢測(cè)或半定量分析。該方法雖然簡(jiǎn)單快速，但靈敏度較差，難以準(zhǔn)確定量。熒光免疫層析技術(shù)作為一項(xiàng)新型免疫檢測(cè)技術(shù)，既保留了傳統(tǒng)膠體金試紙條的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)，又加入了勞光儉測(cè)技術(shù)的高靈敏度特點(diǎn)，成為提高免疫層析方法檢測(cè)性能的主要途徑之一1。

熒光免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以固定有檢測(cè)線(xiàn)(包被抗體或包被抗原)和質(zhì)控線(xiàn)(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記抗體或抗原固定于連接墊，通過(guò)毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)。對(duì)于帶有多個(gè)抗原決定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法，即待測(cè)物在流動(dòng)相作用下先與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線(xiàn)時(shí)再與包被抗體結(jié)合形成雙抗夾心的“三明治”型。對(duì)于只具有單一抗原表位的小分子抗原(農(nóng)獸藥、違禁藥物等)，待測(cè)小分子抗原與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合后，由于空間位阻作用難以再與檢測(cè)線(xiàn)上的包被抗體結(jié)合。所以，具有單一抗原表位的小分子待測(cè)物多采用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法檢測(cè)。

熒光免疫層析分析方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、受自然熒光干擾低等優(yōu)點(diǎn)，成為食品質(zhì)量安全快速檢測(cè)分析研究的熱點(diǎn)。目前，用于熒光免疫分析的標(biāo)記物主要包括熒光素、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米粒子等。

熒光素是指具有熒光特性的有機(jī)染料。1942年Coons等首次報(bào)道了異氰酸熒光素標(biāo)記抗體用于檢測(cè)鼠組織切片中肺炎球菌抗原分布的研究，由此出了免疫熒光技術(shù)。后來(lái)，為了改進(jìn)異氰酸熒光素的性能，Ruggas等合成了性質(zhì)穩(wěn)走、毒性較低的異硫氰酸熒光素。自Marshall等改良了熒光抗體標(biāo)記技術(shù)后，熒光免疫技術(shù)得到快速發(fā)展。目前，應(yīng)用于熒光免疫分析的熒光素主要有5種：異硫氰酸熒光素、四乙烯基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、與酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)和鑭系。

宋春美等采用異硫氰酸灸光素作為標(biāo)記材料標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體，應(yīng)用免疫層析技術(shù)研制萊克名巴胺熒光檢測(cè)試紙條并對(duì)其靈敏度、特異性、重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)定。研究結(jié)果表明，該免疫層析試紙條的檢測(cè)限為1μg/L，較同一抗體的膠體金試紙條的敏感性提高了10倍；與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物物交叉反應(yīng)結(jié)果顯示：該方法具有良好的特異性；以不同批次的檢測(cè)試紙對(duì)牛奶等樣品中萊克多巴膠殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致性較高，重現(xiàn)性良好2。

熒光材料在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用顯著提高了該方法的檢測(cè)性能。然而，有機(jī)染料標(biāo)記物光照下易分解，易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，具有濃度猝滅特征，影響了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將熒光素包裹于聚苯乙烯微球是提高熒光素分析性能的有效方法。

量子點(diǎn)(QuantumDots，QDs)是一種半導(dǎo)體熒光納米顆粒，直徑通常在1-20nm之間，一般由II-VI或III-V族元素組成。與有機(jī)染料熒光標(biāo)記材料相比，量子點(diǎn)具有斯托克斯位移大，激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄，熒光發(fā)射強(qiáng)度強(qiáng)而穩(wěn)定，量子產(chǎn)率高，耐光漂白，成為分析檢測(cè)領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。

白亞龍以紅色CdTe量子點(diǎn)為代表，通過(guò)免疫層析法探討了量子點(diǎn)與小鼠1gG抗體的最佳偶聯(lián)方式，結(jié)果顯示以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(CEDC)與N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的混合物(質(zhì)量比3：4)為偶聯(lián)劑制備的熒光探針性能優(yōu)于直接偶聯(lián)和以DEC和NHS單獨(dú)作為偶聯(lián)劑偶聯(lián)的到的熒光探針；采用硅烷偶聯(lián)試劑APTES氨基化的二氧化硅納米粒子(50-500nm)為載體，通過(guò)偶聯(lián)試劑EDC與NHS將其與CdTe量子點(diǎn)偶聯(lián)，制備得到了高強(qiáng)度的熒光微球；初步研究結(jié)果表明熒光免疫層析方法的靈敏度比膠體金免疫層析體系高4-20倍。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光是指反-斯托克斯發(fā)光，即用低能量的紅外或近紅外光激發(fā)發(fā)射出高能量的紫外或可見(jiàn)光。上轉(zhuǎn)換發(fā)光大都發(fā)生在摻雜稀土離子的化合物中，NaYF2是目前上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率最高的基質(zhì)材料。與熒光染料、量子點(diǎn)相比，上轉(zhuǎn)換納米粒子毒性低，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可避免由于樣品中具有熒光特性基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，是目前理想的熒光標(biāo)記物之一。

王浩然等基于上轉(zhuǎn)換免疫熒光單靶標(biāo)檢測(cè)試紙，成功研制出對(duì)乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌O1和0139群、大腸桿菌O157，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌等10種食源性致病菌具有現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力的十通道試紙盤(pán)檢測(cè)系統(tǒng)，可滿(mǎn)足食品樣品增菌檢測(cè)和腹瀉樣本直接檢測(cè)的靈敏度要求。劉曉等,以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料為標(biāo)記物，建立了可對(duì)奶制品中黃曲霉毒素M1進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析快速定量檢測(cè)方法。最優(yōu)條件下，該方法對(duì)奶粉和牛奶中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)小于15%。該研究構(gòu)建的上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析試紙條檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便快捷、樣品前處理簡(jiǎn)單、具有良好的檢測(cè)敏感性和特異性，對(duì)實(shí)際樣品的耐受性較好，可滿(mǎn)足食品安全中對(duì)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。

Liu等以核殼型NaGdF4：Yb納米顆粒與頭孢氨芐抗體偶聯(lián)作為熒光探針，噴涂于結(jié)合墊，以頭孢氨芐-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠抗抗體分別噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)。最優(yōu)條件下，建立的上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析方法的目測(cè)檢測(cè)線(xiàn)為10ng/mL，定量檢測(cè)的線(xiàn)性范圍為0.5-100ng/mL3。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為: