[科普中國]-免疫酶擴散法

瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agar gel immunodiffusion，AGID)簡稱瓊擴試驗，是在瓊脂凝膠中進行的抗原抗體免疫沉淀反應，可用于血清學定型，簡便快捷。將待檢的純化細菌接種于固體培養(yǎng)基上，刮取培養(yǎng)24 h后的菌苔，懸浮于含85 g/L NaCl、0.02mol/L磷酸鹽、3 m L/L福爾馬林的溶液(pH 7.0)中，100℃水浴加熱1 h，然后以1 500 r/min離心30min，吸取上清液即為待檢抗原。通過觀察待檢抗原與標準抗血清之間是否形成明顯、清晰可見的沉淀線，可以確定血清型。

免疫酶擴散法瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agargelimmunodiffusion，AGID)簡稱瓊擴試驗，是在瓊脂凝膠中進行的抗原抗體免疫沉淀反應，可用于血清學定型，簡便快捷。將待檢的純化細菌接種于固體培養(yǎng)基上，刮取培養(yǎng)24h后的菌苔，懸浮于含85g/LNaCl、0.02mol/L磷酸鹽、3mL/L福爾馬林的溶液(pH7.0)中，100℃水浴加熱1h，然后以1500r/min離心30min，吸取上清液即為待檢抗原。通過觀察待檢抗原與標準抗血清之間是否形成明顯、清晰可見的沉淀線，可以確定血清型1。

免疫酶擴散法的問題血清分離技術(shù)問題被檢動物血清的分離是血清學試驗的必需環(huán)節(jié)。根據(jù)凝血原理，從血液流出到血清析出的時間(健康狀況下)，馬為11.5分鐘，牛為6.5分鐘，綿羊為2.5分鐘，豬為3.5分鐘。在594份牛血液中，有289份采血后，在室溫下斜置5-6小時，血液凝固不好，血面上有一層白色膠凍樣物質(zhì)而沒有血清析出，將血液分組分別在1000℃rpm/分，2000rpm/分，3000rpm/分，4000℃rpm/分離心15-20分鐘，同樣沒有結(jié)果。最后用無菌小玻棒劃破血斜面，于37℃巨溫箱放置30分鐘后，再取出放于4℃冰箱內(nèi)，15-20分鐘就析出清澈透明血清，放置時間越長，析出的血清越多，一般5毫升血液可析出1-2毫升血清。

瓊脂濃度的影響瓊脂濃度決定瓊脂凝膠孔徑的大小，孔徑與濃度呈負相關(guān)(反比)，孔徑的大小直接影響抗原抗體分子的擴散，抗原分子量較大的，擴散時所需孔徑要大，則要求瓊脂濃度稍低，反之亦然。一般瓊脂濃度在1%,0.8%，0.6%時，其凝膠孔徑允許通過的抗原分子量分別在2×10^6,2.5×10^6,3×10^6道爾頓左右。我們進行牛粘膜病、口蹄疫、蘭色病瓊擴抗原與標準陽性血清預試時按規(guī)程要求操作，于37℃恒溫箱48小時不出現(xiàn)沉淀線。經(jīng)實驗，是反復溶化瓊脂時部份水份蒸發(fā)和恒溫箱中濕度不夠，使瓊脂實際濃度過大影響了抗原抗體雙擴散。

pH值、離子強度的影響反復溶化瓊脂對pH值也有影炯，pH值過高或過低可使形成的抗原抗體復合物重新離解。一次性配瓊脂量大，用不完，下次再溶化時不惻pH值，如此反復，使瓊脂液酸堿度不精確而影響沉淀線的出現(xiàn)。所以每次溶化瓊脂，制板前都要用NaOH和HC1重新滴定所要求的pH值。

免疫酶擴散法研究鴨疫里默菌鴨疫里默菌病是由鴨疫里默菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的主要侵害雛鴨、雛火雞等多種禽類的急性或慢性的接觸性傳染病。在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎都有流行，特別是在東南亞國家。在我國由郭玉璞(1982)首次報道。該病多發(fā)生于2周齡～7周齡的小鴨，自然感染發(fā)病鴨臨床表現(xiàn)為精神不振、食欲下降、嗜眠、歪頸、跛行、眼鼻有漿液性或黏液性分泌物，排黃綠稀糞，隨后出現(xiàn)痙攣、搖頭、角弓反張等神經(jīng)癥狀，病愈的鴨體重減輕，生長遲緩。以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為其病變特征。其發(fā)病率在5%～90%、病死率一般在1%～80%，高峰時可達90%甚至100%，目前已成為影響?zhàn)B鴨業(yè)最為嚴重的細菌性傳染病，經(jīng)濟損失嚴重。在診斷上，根據(jù)其流行情況、臨床癥狀和病理變化，一般可做出初步診斷，但確診必須依賴于實驗室技術(shù)手段。目前，RA的診斷方法主要有細菌分離鑒定、瓊脂擴散試驗、凝集試驗、熒光抗體試驗、間接ELISA、PCR、間接免疫酶組織化學法等。

PathanasophonP等根據(jù)瓊擴試驗結(jié)果，提出了20型和21型RA，程安春等提出了4個新的血清型即22型～25型，張大丙等先后鑒定出1，2，6，7，10，11，13，14，15型及17型共10個血清型，并將不同的10型分離株區(qū)分為5個亞型。雖然這個方法特異性比較高，但該試驗結(jié)果反應了不同菌株之間的抗原差異，而非血清型的差異，最終的鑒定還需要依靠其他試驗，并進行大量的細菌對比工作2。

免疫酶擴散法研究蓋他病毒蓋他病毒（Getahvirus，GETV）是一種單鏈線形的RNA病毒屬披膜病毒科甲病毒屬成員，該病毒廣泛分布于亞洲地區(qū)及澳大利亞北部的太平洋沿岸地區(qū)。該病毒可以引起家畜疾病，如馬的發(fā)熱、皮疹、后腿水腫及淋巴結(jié)腫大，并能引起豬的流產(chǎn)等，因此該病毒被確定為重要的動物源性病原體。

免疫酶擴散法操作簡單，但敏感性差?？蛇x用病豬的脾、淋巴結(jié)和回腸小段為病料制備抗原，但以胰腺最好。用pH8．6的巴比妥緩沖液配制1．2%瓊脂，內(nèi)加萬分之一柳硫汞防腐。按中央1孔、周圍6孔的模式打孔，孔徑5mm，孔間距6mm。檢測抗原時，將高免血清滴入中央孔內(nèi)，周圍孔內(nèi)分別加入標準抗原和待檢病料乳劑。檢測抗體時，將標準抗原滴入中央孔內(nèi)，周圍孔的上、下2孔內(nèi)滴加高免血清，其他4孔滴加被檢血清。此方法的最大缺點是誤診率高3。

本詞條內(nèi)容貢獻者為:

梁志宏 - 副教授 - 中國農(nóng)業(yè)大學