[科普中國]-共聚焦激光掃描顯微

共聚焦激光掃描顯微（英語：Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一項(xiàng)高分辨率三維光學(xué)成像技術(shù)。主要特點(diǎn)在于其光學(xué)分層能力，即獲得特定深度下焦點(diǎn)內(nèi)的圖像。圖像通過逐點(diǎn)采集，以及之后的計(jì)算機(jī)重構(gòu)而成。因此它可以重建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的物體。

詳解共聚焦激光掃描顯微（英語：Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一項(xiàng)高分辨率三維光學(xué)成像技術(shù)。1主要特點(diǎn)在于其光學(xué)分層能力，即獲得特定深度下焦點(diǎn)內(nèi)的圖像。圖像通過逐點(diǎn)采集，以及之后的計(jì)算機(jī)重構(gòu)而成。因此它可以重建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的物體。對(duì)于不透明樣品，可以進(jìn)行表面作圖，而對(duì)于透明樣品，則可以進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)成像。內(nèi)部結(jié)構(gòu)成像上，圖像質(zhì)量在單臺(tái)顯微鏡中就可以得到極大的提升，因?yàn)閬碜詷悠凡煌疃鹊男畔⑽幢恢丿B。傳統(tǒng)顯微鏡能“看”到所有能被光投身到地方，而對(duì)于共聚焦顯微鏡，只有焦點(diǎn)處的信息被采集。實(shí)際上共聚焦激光掃描顯微是通過對(duì)焦點(diǎn)深度的控制和高度限制來實(shí)現(xiàn)的。

共聚焦的原理早在1957年就由美國科學(xué)家馬文·明斯基注冊為專利，但實(shí)際上經(jīng)過三十年的時(shí)間及相應(yīng)專用激光器的發(fā)展，直至1980年代末這項(xiàng)技術(shù)才成為標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。1978年，托馬斯和克里斯托弗·克萊默設(shè)計(jì)出一套激光掃描程序。該程序采用激光聚焦的方式逐點(diǎn)掃描物體三維表面，并通過類似于掃描電鏡的計(jì)算機(jī)化手段生成圖像。這一共聚焦激光掃描顯微設(shè)計(jì)首次結(jié)合了激光掃描方法和熒光標(biāo)記的生物樣品三維探測。接下來的數(shù)十年內(nèi)，共聚焦熒光顯微發(fā)展成一項(xiàng)成熟的技術(shù)，尤其受益于阿姆斯特丹大學(xué)（University of Amsterdam），來自海德堡的歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室（European Molecular Biology Laboratory）及其業(yè)界伙伴的共同努力。

共聚焦顯微鏡提供了完整，厚實(shí)，活體標(biāo)本的直接，無創(chuàng)，連續(xù)光學(xué)切片的能力，最小化樣品制備以及橫向分辨率的微小改善。生物樣品通常用熒光染料處理，以使選定的物體可見。然而，實(shí)際的染料濃度可以很低，以最小化生物系統(tǒng)的干擾：一些儀器可以跟蹤單個(gè)熒光分子。此外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以產(chǎn)生生成其自身熒光嵌合分子的生物（例如GFP，綠色熒光蛋白的融合體）用感興趣的蛋白質(zhì)）。共聚焦顯微鏡的工作原理是樣品中的點(diǎn)激發(fā)（衍射極限點(diǎn)）和所得熒光信號(hào)的點(diǎn)檢測。探測器上的針孔提供了阻擋離焦熒光的物理屏障。僅記錄通風(fēng)盤的對(duì)焦或中心點(diǎn)。光柵一次掃描一個(gè)樣本允許通過簡單地改變z焦點(diǎn)來收集薄的光學(xué)部分?？梢远询B所得到的圖像以產(chǎn)生樣本的3D圖像。

用于水平掃描的顯微技術(shù)市面上有四種類型的共焦顯微鏡：

共聚焦激光掃描顯微鏡使用多個(gè)鏡子（通常沿x軸和y軸線性掃描2或3個(gè)）來掃描樣品上的激光，并通過固定的針孔和檢測器“掃描”圖像。

旋轉(zhuǎn)盤（Nipkow盤）共焦顯微鏡在盤上使用一系列移動(dòng)針孔來掃描光點(diǎn)。由于一系列針孔平行掃描一個(gè)區(qū)域，因此與激光掃描顯微鏡相比，允許每個(gè)針孔在特定區(qū)域上懸停更長的時(shí)間，從而減少照射樣品所需的激發(fā)能量。降低的激發(fā)能量減少了樣品的光毒性和光漂白，使其成為用于成像活細(xì)胞或生物體的優(yōu)選系統(tǒng)。

微透鏡增強(qiáng)或雙旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的工作原理與旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡相同，只是在含有針孔的旋轉(zhuǎn)盤之前放置含有微透鏡的第二個(gè)旋轉(zhuǎn)盤。每個(gè)針孔都有一個(gè)相關(guān)的微透鏡。微透鏡用于捕獲寬帶光并將其聚焦到每個(gè)針孔中，從而顯著增加引入每個(gè)針孔的光量并減少旋轉(zhuǎn)盤阻擋的光量。因此，微透鏡增強(qiáng)型共聚焦顯微鏡比標(biāo)準(zhǔn)旋轉(zhuǎn)磁盤系統(tǒng)更敏感。橫河電機(jī)于1992年發(fā)明了這項(xiàng)技術(shù)。

**可編程陣列顯微鏡（PAM）**使用電子控制的空間光調(diào)制器（SLM），產(chǎn)生一組移動(dòng)的針孔。SLM是包含像素陣列的設(shè)備，其具有可以電子調(diào)整的各個(gè)像素的一些屬性（不透明度，反射率或旋光度）。SLM包含微機(jī)電鏡或液晶組件。圖像通常由電荷耦合器件（CCD）相機(jī)獲取。

這些類共焦顯微鏡中的每一種都具有特定的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。大多數(shù)系統(tǒng)要么針對(duì)記錄速度（即視頻捕獲）或高空間分辨率進(jìn)行了優(yōu)化。共聚焦激光掃描顯微鏡可以具有可編程的采樣密度和非常高的分辨率，而Nipkow和PAM使用由相機(jī)分辨率定義的固定采樣密度。單點(diǎn)激光掃描系統(tǒng)的成像幀速率通常比旋轉(zhuǎn)磁盤或PAM系統(tǒng)慢。商用旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的幀速率超過每秒50幀- 這是動(dòng)態(tài)觀察（如活細(xì)胞成像）的理想特征。

在實(shí)踐中，只要針孔距離足夠遠(yuǎn)，Nipkow和PAM就允許多個(gè)針孔平行掃描同一區(qū)域。

共焦激光掃描顯微鏡的前沿開發(fā)現(xiàn)在通過使用多個(gè)微機(jī)電掃描鏡，可以比標(biāo)準(zhǔn)視頻速率（每秒60幀）成像更好。

共聚焦X射線熒光成像是一種較新的技術(shù)，除了水平和垂直瞄準(zhǔn)外，還可以控制深度，例如，在分析繪畫中的埋藏層時(shí)。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

劉軍 - 副研究員 - 中國科學(xué)院工程熱物理研究所